雷替曲塞对人胃癌裸鼠移植瘤生长的影响及其机制

洪 雷 李 华 常 靓 刘 巍

胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TS）是化疗药物治疗的一个重要靶点［1］，自1957年5-Fu问世以来，TS抑制剂一直是胃肠道肿瘤不可或缺的基石药物。雷替曲塞是一种喹唑啉叶酸盐类似物，为新型的TS抑制剂，它通过叶酸盐转运载体（RFC）转运至细胞内，在叶酸多聚谷氨酸合成酶（FPGS）作用下迅速代谢为一系列的多聚谷氨酰化合物，抑制TS的活性，进而导致DNA断裂和细胞死亡［2］。自1996年雷替曲塞上市，其研究多集中于直结肠癌治疗领域，目前主要推荐应用于不耐受或不适用5-Fu联用亚叶酸钙的晚期结直肠癌的一线治疗［3］，但其在胃癌治疗领域的研究甚少，国内也是如此。

本研究拟通过建立人胃癌细胞MGC-803裸鼠实验模型，分别给予雷替曲塞、5-Fu、生理盐水药物干预，分析三种干预措施对人胃癌细胞MGC-803裸鼠移植瘤模型的抑瘤作用并通过流式细胞仪、RT-PCR及Western blot印迹法方法对相关指标进行检测，进一步探讨其作用机制，为指导胃癌临床化疗药物的选择，寻找新的依据和思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与细胞株 实验1周前购入BALB/c裸鼠、雌性、4周龄、体重15～19 g。购自北京华阜康生物科技股份有限公司（动物合格证号：0000013647）。试验共用24只，分笼饲养。人胃癌细胞株MGC-803由中国科学院上海生命科学研究院提供。本试验经科研机构伦理委员会审查批准，符合国家有关实验动物“保护规范”和管理条例。

1.1.2 主要试剂 小鼠抗人p53单克隆抗体，兔抗人GAPDH多克隆抗体，均购自美国Santa Cruz公司。注射用雷替曲塞，购自南京正大天晴公司。5-Fu，购自天津金耀氨基酸有限公司。

1.2 方法

1.2.1 人胃癌细胞MGC-803裸鼠皮下移植瘤模型的建立 收集人胃癌细胞MGC-803对数生长期细胞，经0.25%胰蛋白酶消化1 min，制备成浓度为1×107/mL的单细胞悬液，在超净台内于裸鼠腋下皮下注射0.2 mL单细胞悬液（含活细胞数2×106个）。术后裸鼠全部存活，无明显不适反应。1周后裸鼠出现直径＞5 mm的皮下结节。

1.2.2 裸鼠分组及药物干预 裸鼠造模成功后，待扪及皮下肿瘤直径约5～9 mm时，随机分组为对照组、雷替曲塞组（7.5 mg/kg/d）、5-Fu（12 mg/kg/d），每组8只，分别给予裸鼠腹腔注射雷替曲塞、5-Fu、生理盐水，每只0.2 mL，连续5 d，休息2 d后，继续给药5 d［2］。末次用药2d后，以颈椎脱位方式处死裸鼠，连同包膜完整剥出肿瘤组织，观察瘤体大体形态，一部分瘤体浸泡于70%酒精溶液，用于流式细胞分析，另一部分保存于-80℃超低温冰箱，用于RT-PCR及Western blot检测。

1.2.3 裸鼠观察 密切观察各组裸鼠的精神状态、饮食、大便情况等，并称重。

1.2.4 雷替曲塞和5-Fu对人胃癌细胞MGC-803裸鼠皮下移植瘤生长的影响 每隔3d用游标卡尺测量测量肿瘤长径（A）和垂直横径（B），按公式V=A×B2/2计算肿瘤体积，描绘肿瘤体积增长曲线。待肿瘤组织取出后，称取肿瘤组织质量，按公式抑瘤率=（对照组瘤重-实验组瘤重）/对照组瘤重×100%，计算抑瘤率。

1.2.5 测定裸鼠瘤细胞的细胞周期分布和凋亡 将固定好的肿瘤组织剪碎、捻搓直至肿瘤组织搓完为止，过滤去除混浊液的杂质，离心沉淀后弃掉上清。将细胞用70%乙醇（4℃预冷）固定，并用Rnase酶消化。在4℃冰箱加入溴化丙啶（PI）1 mL避光染色30 min，过滤，制成单细胞悬液供上机检测。应用MuticycleAV分析软件对DNA周期进行拟合分析，计算出细胞周期分布的百分率及凋亡百分率。

1.2.6 RT-PCR法检测p53 mRNA的表达 1）RNA提取及RNA浓度和纯度测定：取各组肿瘤组织各约200 mg，TRIzol法进行RNA提取。用紫外分光光度计分别测定260 nm（OD260）和280 nm（OD280）吸光度值，当1.8＜OD260/OD280＜2.0时，说明RNA纯度合格。根据OD260值按以下公式计算RNA浓度：RNA浓度（μg/mL）=40×OD260×稀释倍数。2）逆转录合成cDNA第一链：建立逆转录反应体系：mRNA（1 μg/μL）2.0 μL，5×Buffer 2.0 μL，dNTP（10 mM）2.0 μL，Oligo（dT）15 1.0 μL，AMV酶1.5 μL，DEPC水12.5 μL。取2.0 μL总RNA70℃预变性10 min，然后按照上面体系加入其它成分，以下列条件：25℃1 min，42℃ 60 min，98℃ 5 min，4℃ 10 min，反转录成cDNA。设计引物（P53：上游：5'-CTGCCCTCAACAAGA TGTTTTG-3'，下游：5'-CTATCTGAGCAGCAGCGCTCA TGG-3'；GAPDH：上游：5'-ACCTGACCTGCCGTCTAG AA-3'，下游：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'），以合成的cDNA为模板，进行目的基因的扩增（反应条件：94℃预变性5 min，循环参数：94℃ 45 s，Tm℃ 45 s，72℃45 s，共循环30次，72℃延伸7 min）。将每个目的基因的PCR扩增产物6 μL于1.5%琼脂糖凝胶中电泳，恒压80 V，电泳30 min，扩增产物以GAPDH基因作内参照，采用gelpro analysis 3.1软件进行扫描观察结果。

1.2.7 Western blot法检测p53蛋白的表达 取各组肿瘤组织约100 mg，加入1 mL组织裂解液，于研钵内（0℃冰浴中）研磨成浆状后，4℃裂解1 h，离心，取上清液即为蛋白，用BCA法进行蛋白定量测定，根据BCA蛋白定量试剂盒说明书进行操作。取80 μg蛋白，按1:3加入（5 μL）4×上样缓冲液，煮沸变性5 min，迅速低温冷却后加样，琼脂糖凝胶电泳，小心切取含目的蛋白条带的的胶块。取与保留胶块大小一致的PVDF膜，处理完毕后，开始转膜。电泳条件：80V，4℃，2 h。转膜完毕后，小心取出PVDF膜，在1×TBST缓冲液中泡洗（去除背景非特异杂交信号），弃去1×TBST缓冲液后，加入配好的封闭液，4℃过夜。用蜡纸折一船形小盒，将封闭好的放入小盒内，快速加入鼠抗人p53单克隆抗体（1:1 000）或GAPDH单克隆抗体应用液（1:2 000），将小盒放入保湿盒中，4℃过夜。取出经一抗作用的PVDF膜，用1×TBST缓冲液在摇床上洗涤3次，10 min/次。然后另做一船形小盒，将洗涤过的PVDF膜放入盒中，加入TBS-T稀释的红外荧光标记的相应二抗（稀释比例为1:20 000），37℃避光缓慢摇动1 h。取出经二抗作用的PVDF膜，用1×TBST缓冲液在摇床上洗涤3次，20 min/次，用Odyssey双色红外荧光扫描系统进行检测。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0软件对各组数据进行统计分析。实验数据以表示，多组样本间均数比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荷瘤裸鼠一般状态及瘤重、抑瘤率计算

与对照组裸鼠相比，用药30 min内，雷替曲塞组和5-Fu组裸鼠精神较差，活动明显较前减少；30 min后，精神状态及活动逐渐恢复。于第3天雷替曲塞组和5-Fu组出现大便干燥现象，对照组大便良好，10 d左右雷替曲塞组和5-Fu组裸鼠大便逐渐正常。荷瘤裸鼠末次体重、瘤体积变化、瘤重以及抑瘤率情况见表1、2，图1。

表1 干预后裸鼠体重及移植瘤体积 Table 1 Body weight and tumor volume of nude mice after intervention

表1 干预后裸鼠体重及移植瘤体积 Table 1 Body weight and tumor volume of nude mice after intervention

Note：One-way ANOVA，*P＜0.01 versus control，#P＜0.05 versus 5-Fu

19.60±1.78*#17.79±1.16*21.75±2.13 657.89±59.47*706.14±64.42*1 232.02±109.69 Raltitrexed 5-Fu Control

表2 干预后裸鼠移植瘤瘤重 Table 2 Tumor weight of the nude mice after intervention

表2 干预后裸鼠移植瘤瘤重 Table 2 Tumor weight of the nude mice after intervention

0.78±0.06*0.83±0.08*1.53±0.13 49.02 45.75 0 Raltitrexed 5-Fu Control Note：One-way ANOVA，*P＜0.01 versus control

图1 各组胃癌细胞裸鼠移植瘤体积变化曲线Figure 1 Curves of the tumor volume of the gastric cancer cells subcutaneously transplanted in nude mice under different groups

2.2 荷瘤裸鼠瘤细胞的细胞周期分布和凋亡改变

各组瘤细胞G0/G1期比例结果分别为：雷替曲塞组：（53.40±3.84）%，5-Fu 组：（52.26±3.44）%，对照组：（62.65±2.54）%。各组S期比例结果分别为：雷替曲塞组：（29.29±2.29）%，5-Fu组：（29.15±2.77）%，对照组：（20.78±3.93）%；各组G2/S期比例结果分别为：雷替曲塞组：（17.44±2.36）%，5-Fu组：（18.71±4.33%），对照组：（16.82±1.45）%。雷替曲塞组和5-Fu组瘤细胞的G0/G1期比例较对照组明显减低（P＜0.01），而S期比例较对照组明显升高；但两组之间G0/G1期、S期均无统计学差异（P＞0.05）。三组G2/S期比例之间无统计学差异（P＞0.05，表3）。

表3 胃癌MGC-803裸鼠移植瘤细胞在各组细胞周期分布 （±s）Table 3 Cell cycle distribution of MGC-803 gastric cancer cells subcutaneously transplanted in nude mice in different groups（±s）

表3 胃癌MGC-803裸鼠移植瘤细胞在各组细胞周期分布 （±s）Table 3 Cell cycle distribution of MGC-803 gastric cancer cells subcutaneously transplanted in nude mice in different groups（±s）

Note：One-way ANOVA，*P＜0.01 versus control

S（%）53.40±3.84*52.26±3.44*62.65±2.54 G0/G1（%）29.29±2.29*29.15±2.77*20.78±3.93 G2/M（%）17.44±2.36 18.71±4.33 16.82±1.45 Group Raltitrexed 5-Fu Control

各组瘤细胞的凋亡率：三组之间的凋亡率有统计学意义，与对照组的凋亡率相比，雷替曲塞组和5-Fu组的瘤细胞凋亡率显著高于对照组（P＜0.01），而雷替曲塞组的瘤细胞凋亡率也高于5-Fu组的凋亡率（P＜0.05，表4）。

表4 胃癌MGC-803裸鼠移植瘤细胞在各组凋亡率 （±s）Table 4 Apoptotic rate of MGC-803 gastric cancer cells subcutaneously transplanted in nude mice under different groups（±s）

表4 胃癌MGC-803裸鼠移植瘤细胞在各组凋亡率 （±s）Table 4 Apoptotic rate of MGC-803 gastric cancer cells subcutaneously transplanted in nude mice under different groups（±s）

Apoptotic rate（%）35.94±2.60*#33.89±2.55*26.18±1.23 Group Raltitrexed 5-Fu Control Note：One-way ANOVA，*P＜0.01 versus control，#P＜0.05 versus 5-Fu

2.3 荷瘤裸鼠肿瘤p53 mRNA表达水平的改变

雷替曲塞组中裸鼠肿瘤p53 mRNA相对表达量为：（0.521±0.046）%；5-Fu组中裸鼠肿瘤p53 mRNA相对表达量为：（0.487±0.041）%；对照组中裸鼠肿瘤p53 mRNA相对表达量为：（0.159±0.025）%。与对照组相比，雷替曲塞组和5-Fu组中裸鼠肿瘤p53 mRNA表达水平显著升高（P＜0.01），而雷替曲塞组和5-Fu组中裸鼠肿瘤p53 mRNA表达无明显差异（P＞0.05，图2）。

2.4 荷瘤裸鼠肿瘤p53蛋白表达水平的改变

雷替曲塞组中裸鼠肿瘤p53蛋白相对表达量为：（0.509±0.049）%；5-Fu组中裸鼠肿瘤p53蛋白相对表达量为：（0.474±0.034）%；对照组中裸鼠肿瘤p53蛋白相对表达量为：（0.193±0.021）%。与对照组相比，雷替曲塞组和5-Fu组中裸鼠肿瘤p53蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），而雷替曲塞组和5-Fu组中裸鼠肿瘤p53蛋白表达无明显差异（P＞0.05）。这与RT-PCR检测p53mRNA表达水平结果一致（图3）。

图2 干预后各组p53mRNA表达变化Figure 2 Changes in the p53 mRNA expression after intervention in nude mice under different groups

图3 干预后各组P53蛋白表达变化Figure 3 Changes in the p53 protein expression after intervention in nude mice under different groups

3 讨论

5-Fu是TS抑制剂中嘧啶类似物中的经典药物，但5-Fu对TS的抑制却是非特异性的。5-Fu的一些代谢物（即FUTP和FdUTP）的结合的靶点并不是TS，它们迅速结合RNA和DNA，进而产生了其他的细胞效应，成为5-Fu副作用产生的根源［4］。另外，虽然持续静脉滴注弥补了5-Fu半衰期短的缺陷，但其血管毒性及伴随而来埋至中央静脉导管及其护理的问题给患者的生活质量带来诸多影响。

雷替曲塞对TS的抑制作用具有高度特异性，抑制作用是二氢叶酸还原酶的100倍，其产生的一系列多聚谷氨酰化合物是比雷替曲塞更强的TS抑制剂，它们潴留在细胞内产生了更强的TS抑制作用，并延长了作用时间［5］。机制上的优势引发了众多学者对雷替曲塞疗效的期待。单药雷替曲塞与5-Fu/LV在晚期大肠癌疗效上的3个大型实验（Cunningham，1996；Harper，1997；Pardur and Vincent，1997）奠定了雷替曲塞在直结肠癌一线治疗的地位［6］。目前研究显示雷替曲塞组和5-Fu/LV组客观应答率、总缓解率、中位生存时间、中位疾病进展时间差异均无统计学意义，疗效相似［7］。在毒性反应方面，5-Fu/LV组患者口腔黏膜炎发生率、白细胞减少以及腹泻［6］、心脏毒性［8］均较雷替曲塞组高，但在贫血和乏力方面，雷替曲塞的发生率要明显高于5-Fu［9］。毒性上的差异，成为了雷替曲塞用于不能耐受5-Fu联用亚叶酸钙晚期至结肠癌患者一线治疗的重要依据。

目前，雷替曲塞在胃癌上的应用的研究甚少，且多为小样本研究，代表性差。日本一项研究通过建立人胃癌SC-1-NU细胞荷瘤裸鼠模型，对雷替曲塞与5-Fu两药进行了比较并检测TS活性和F-RNA水平。结果显示：各治疗组的抗肿瘤活性是相似的，TS抑制率有明显的统计学差异，而F-RNA水平和抗肿瘤活性无关［10］。本试验按照这一试验的给药剂量和给药方式，建立人胃癌MGC-803细胞荷瘤鼠模型。

p53基因有“基因卫士”的称号，p53蛋白在细胞应对外界环境和自身的各种应激中起着至关重要的作用，p53位于这些应激信号的中心，将应激信号传入细胞中，并作为转录因子促进下游目的基因的转录，进而来实现其短暂或长期阻滞细胞周期（分化或衰老）、DNA复制与修复及细胞凋亡的功能［11-12］，从而维持细胞基因组的完整性或阻止癌细胞的早期增殖。本试验采用RT-PCR和Western blot印迹法从基因和蛋白两种水平上检测p53 mRNA及P53蛋白的表达水平，结果显示：雷替曲塞组和5-Fu组的p53 mRNA和蛋白表达水平较对照组均明显增高（P均＜0.05），但二者之间无明显差异（P＞0.05）。结果再次证实了雷替曲塞及5-Fu的抗肿瘤活性相当。

恶性肿瘤的重要特征之一是不受控制的细胞增殖。大多数恶性肿瘤的发生、发展与细胞周期调控功能紊乱有关。雷替曲塞可以使头颈部鳞癌Cal27和结直肠癌HT29细胞株细胞S期的比例上升，从而将细胞进程阻滞在S期［13］。本实验中雷替曲塞组和5-Fu组瘤细胞的G0/G1期比例较对照组明显降低（P＜0.01），而S期比例较对照组明显升高；但两组之间G0/G1期、S期均无统计学差异（P＞0.05），这与既往研究较为一致。

本试验中三组裸鼠瘤细胞的凋亡率之间差异有统计学意义。与对照组相比，雷替曲塞组和5-Fu组的瘤细胞凋亡率显著高于对照组（P＜0.01），而雷替曲塞组的瘤细胞凋亡率也高于5-Fu组（P＜0.05）。上述PT-PCR和Westen blot结果显示雷替曲塞组和5-Fu组的p53 mRNA及蛋白表达水平上升，而p53诱导的细胞凋亡机制非常复杂，包含转录依赖活性和非转录依赖活性两种调控机制。一方面p53作为重要的转录因子，通过转录激活p53、AIPI、Fas、Bax等来实现凋亡诱导作用［14］。另一方面，p53可以和位于线粒体膜上的Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1相互作用，而这些蛋白一旦和p53结合，便丧失了稳定线粒体膜的作用，从而使线粒体膜的通透性改变，导致细胞色素c释放，进而诱导细胞凋亡［15］。本实验中雷替曲塞组瘤细胞的凋亡率高于5-Fu组的凋亡率，这可能与本研究样本量小影响统计学效能有关，且雷替曲塞的促进凋亡机制可能与5-Fu不完全一样，还需要进一步的试验研究探索。但从整体的试验数据分析，雷替曲塞和5-Fu抑瘤效果是相似的。

总之，本研究通过建立人胃癌MGC-803细胞荷瘤鼠模型，证实雷替曲塞对人胃癌细胞MGC-803裸鼠有抑瘤作用，且雷替曲塞和5-Fu之间的抑瘤作用无明显统计学差异。从本动物试验的依据角度来看，实验结果为临床上不能耐受5-Fu的胃癌患者治疗提供了另一种选择。但这还需要大量的临床试验证明，故雷替曲塞在胃癌的治疗上值得更深入的研究。

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