叉毛蓬体外抗氧化活性的研究

孙文，王莹，孙叶帅，朱林，马瑶，杨红兵

（石河子大学化学化工学院/新疆兵团化工绿色过程重点实验室/省部共建国家重点实验室培育基地，石河子 832003）

自由基是有机化合物发生化学反应时产生的含有一个不成对电子的原子团，主要包括超氧阴离子自由基、羟基自由基、烷基自由基、脂质过氧化自由基等[1]。自由基及其诱导的氧化反应是导致生物衰老和某些疾病如癌症、糖尿病、心血管疾病的重要因素[2-3]。目前在医疗和食品领域中，使用较多的是合成抗氧化剂（如BHA，BHT，TBHQ等）来消除人体内的自由基[4]，近年来人们发现经人工合成的抗氧化剂皆有一定的毒性[5]，而传统中草药和天然植物中含有许多自由基清除剂（如黄酮类、酚类、生物碱类等），均有较强的抗氧化作用，且安全、健康、无毒[6]。因此，从植物中寻找和开发能够清除自由基的天然抗氧化剂已成为当今的研究热点。

叉毛蓬（Petrosimonia sibirica L.）为藜科（Chenopodiaceae）叉毛蓬属（Petrosimonia Bunge）一年生草本植物，大多生长在干旱、盐碱地区，主要分布于新疆，是新疆的特色植物。叉毛蓬粗蛋白含量与禾草相近，具有一定的饲用价值，是荒漠草场中良好的牧草之一[7-9]。

藜科植物在我国分布广泛，所含化学成分种类丰富，其生物活性的研究也越来越受到重视[10]。目前，国内外对叉毛蓬的研究主要集中在遗传学[11]和生态学[12]方面，有关其化学成分和活性研究的报道较少。据本课题组前期研究工作得知，叉毛蓬提取物具有良好的抗菌活性[13]。本文以叉毛蓬为研究对象，利用3三种不用的抗氧化性方法研究其抗氧化活性，以期为进一步追踪分离叉毛蓬中的活性成分提供参考，也为新疆藜科植物的合理开发和利用积累科学依据。

1 材料、试剂、仪器

1.1 材料与试剂

叉毛蓬全株于2011年9月采自新疆玛纳斯，由石河子大学生命科学学院闫平教授鉴定。2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl（DPPH），Tert-Butylhydroquinone （TBHQ） 购自 Sigma公司；2,4,6-Tris （2-pyridyl）-s-triazine（TPTZ），购自阿拉丁公司；抗坏血酸（AA），FeCl3·6H2O，FeSO4·7H2O，焦性没食子酸，乙酸钠，冰醋酸，甲醇等均为分析纯。

1.2 仪器

Rotavapor R-220旋转蒸发仪，B-490型电热恒温水浴锅，GZX-9030 MBE电热鼓风干燥箱，SHZDⅢ型循环水真空泵，电子天平，紫外可见分光光度计，KDM型调温电热套。

2 实验方法

2.1 叉毛蓬提取物的制备

2.2 DPPH自由基清除率的测定[14]

配置0.1 mmol/L的DPPH甲醇溶液待用。在试管中分别加入2 mL不同浓度的待测液和2 mL的DPPH甲醇溶液，摇匀，避光静置30 min，然后在波长517 nm处测其吸光度。抗坏血酸（AA）和叔丁基对苯二酚（TBHQ）作阳性对照。按下式计算DPPH自由基清除率，

上式中：An为2 mL待测液与2 mL DPPH甲醇溶液混合后的吸光度值；Am为2 mL甲醇与2 mL DPPH甲醇溶液混合后的吸光度值。

2.3 O2-·自由基清除率的测定[15]

2.3.1 邻苯三酚自氧化速率的测定

量取 5 mL，pH 8.2的 50 mmol/L的 Tris-HCl缓冲液和2 mL双蒸水，混匀后放于25℃水浴中恒温20 min，然后立即加入在25℃下预热过的3 mmol/L的邻苯三酚0.5 mL（以10 mmol/L HCl配制，空白管用10 mmol/L HCl代替邻苯三酚盐酸溶液)，迅速摇匀后在325 nm处每隔30 s，测其吸光度。

2.3.2 样品活性的测定

按2.3.1中步骤进行测定，加邻苯三酚前加入0.2 mL不同浓度的待测液，双蒸水的量随之减少。抗坏血酸（AA）作阳性对照。按下式计算O2-·自由基清除率。

式（2）中：A0为邻苯三酚自氧化吸光度值；A1为加入样品溶液后邻苯三酚自氧化吸光度值。

2.4 铁离子还原能力的测定-FRAP法[16]

2.4.1 FRAP工作液的配置

凯安跟我说，学校的所有孩子都很羡慕他。上次，他跟同学说下课以后要赶紧回家把作业做完，这样就能跟哥哥玩弹珠，同学们都对他说：“你好幸运哦！我们回家要是写完作业，爸爸妈妈会很高兴。因为他们能够给我们布置更多的家庭作业，把我们累死了。所以，我们回家以后尽量拖拖拉拉写作业，为了避免做更多的作业。”

0.3 mol/L pH 3.6 的醋酸盐缓冲液（a）；10 mmol/L TPTZ溶液用 40 mmol/L的 HCl配置（b）；20 mmol/L FeCl3溶液（c）。FRAP 工作液由 a∶b∶c=10∶1∶1 配置而成。

2.4.2 FeSO4标准曲线的绘制

吸取不同浓度的FeSO4标准溶液0.1 mL，然后各加入3.0 mL的FRAP工作液和0.3 mL蒸馏水，充分混匀后，37℃反应30 min，于593 nm处测其吸光度。根据FeSO4的浓度与吸光度值绘制标准曲线，得线性回归方程：y=0.702x+0.084，R2=0.9942。

2.4.3 样品活性的测定

按2.4.2中步骤进行测定。待测液的还原能力用FeSO4的当量（mmol/g）表示，即 1 g提取物的还原能力与多少mmol FeSO4的还原能力相当。抗坏血酸（AA）和叔丁基对苯二酚（TBHQ）作阳性对照。

3 结果与分析

3.1 DPPH自由基清除率的测定

DPPH自由基是一种稳定的自由基，其清除实验是体外抗氧化活性评价方法中常用的一种[17]。样品的DPPH自由基清除能力一般以半数抑制率IC50值表示，IC50值越小表明样品的抗氧化能力越强[18]。

叉毛蓬提取物清除DPPH自由基的效果如图1所示。图1显示：DPPH自由基的清除率均随着提取物浓度的增加而增大，并且在一定浓度范围内存在量效关系。当浓度为1 mg/mL时，自由基清除率由大到小的排列顺序为：乙酸乙酯提取物﹥氯仿提取物﹥正丁醇提取物﹥石油醚提取物﹥乙醇粗提，且它们的值分别为 96.68%、91.24%、90.41%、89.04%和79.25%。

由表1可知，叉毛蓬乙酸乙酯提取物及氯仿提取物的抗氧化能力较好，IC50值分别为69.69 μg/mL，78.91 μg/mL，但均低于阳性对照 AA（IC50=3.61 μg/mL）和 TBHQ（IC50=3.41 μg/mL）。

图1 叉毛蓬不同提取物清除DPPH自由基的能力Fig.1 DPPH free radical scavenging activity of the different extracts of Petrosimonia sibirica

3.2 O2-自由基清除率的测定

O2-自由基是一种活性氧，是机体内寿命最长的自由基，通常作为自由基链式反应的引发剂，产生活性更强的自由基，进一步对机体造成伤害[19]。因此，对O2-·自由基的清除能力进行测定具有非常重要的意义。

由图2可知，石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物在整个浓度测定范围内都呈现了较好的量效关系，O2-·自由基清除率的变化范围分别为 2.28%～32.07%、13.97%～73.43%、16.83%～84.88%以及26.74%～51.14%。

由表1可知：叉毛蓬乙酸乙酯提取物的抗氧化能力最好 （IC50=6.57 mg/mL），其次是氯仿提取物（IC50=7.59 mg/mL），但均弱于阳性对照AA （IC50=0.44 mg/mL）。

图2 叉毛蓬不同提取物清除O2-·自由基的能力Fig.2 O2-free radical scavenging activity of the different extracts of Petrosimonia sibirica

3.3 铁离子还原能力的测定-FRAP法

铁离子还原法是对总的抗氧化能力进行的评价，它是基于黄色的Fe3+-TPTZ络合物可被还原性物质还原为蓝色Fe2+-TPTZ络合物这一反应过程中颜色的变化。Fe2+-TPTZ在593 nm处有特征吸收，吸光度值越大，表明抗氧化剂的还原能力越强，则抗氧化性也越强[20]。

由表1可知，叉毛蓬不同溶剂提取物间的还原能力相差不大，提取物及阳性对照的抗氧化能力由强到弱的顺序为：TBHQ﹥AA﹥氯仿提取物﹥乙酸乙酯提取物﹥正丁醇提取物﹥乙醇粗提物﹥石油醚提取物。

表1 叉毛蓬不同提取物的抗氧化活性Tab.1 Antioxidant activity of the different extracts of Petrosimonia sibirica

4 结论

1）在采用DPPH和邻苯三酚自氧化2种方法中，叉毛蓬提取物的抗氧化活性顺序一致，具体表现为：乙酸乙酯提取物﹥氯仿提取物﹥正丁醇提取物﹥石油醚提取物﹥乙醇粗提物。

2）采用FRAP法，抗氧化活性顺序为：氯仿提取物﹥乙酸乙酯提取物﹥正丁醇提取物﹥乙醇粗提物﹥石油醚提取物。

3）氯仿提取物和乙酸乙酯提取物的抗氧化活性最好，通常情况下氯仿或乙酸乙酯溶剂主要萃取游离生物碱、黄酮、有机酸等中等极性化合物，这表明叉毛蓬可能含有丰富的生物碱、黄酮等活性成分。

[1]黄晓昆,黄晓冬,卞美君.南方碱蓬叶黄酮类化合物含量及其体外抗氧化活性研究[J].安徽农业科学,2010,38(3):1432-1434,1542.

[2]Ji X Y,Tan B K H,Zhu Y C,et al.Comparison of cardioprotective effects using ramipril and danshen for the treatment of acute myocardial infarction in rats[J].Life Sciences,2003,73(11):1413-1426.

[3]Enujiugha V N,Talabi J Y,Malomo S A,et al.DPPH radical scavenging capacity of phenolic extracts from African yam bean (Sphenostylis stenocarpa)[J].Food and Nutrition Sciences,2012,3(1):7-13.

[4]Shukla S,Mehta A,Bajpai V K,et al.In vitro antioxidant activity and total phenolic content of ethanolic leaf extract of Stevia rebaudiana Bert.[J].Food and Chemical Toxicology,2009,47(9):2338-2343.

[5]张亮亮,杨志伟,林益明.橄榄多酚抗氧化活性研究[J].食品工业科技,2008,29(4):57-59.

[6]叶怀庄,王明达,陈日萍.TOSC法对20种中草药抗氧化能力的体外测定[J].浙江中医杂志,2002,6(8):445-447.

[7]吕光辉.新疆克拉玛依动植物名录[M].乌鲁木齐市:新疆人民出版社,2008:187.

[8]孔宪武,朱格麟,简焯坡,等.中国藜科植物[J].植物分类学报,1978,16(1):99-123.

[9]孔宪武,简焯坡.中国植物志 [M].北京:科学出版社,1979,25:190-194.

[10]杜华,周立刚,李春,等.藜科植物化学成分与生物活性的研究进展[J].天然产物研究与开发,2007,19(5):884-889.

[11]王袆玲,闫桂琴,徐莉,等.新疆阜康荒漠地区叉毛蓬居群的遗传结构和分化[J].西北植物学报,2003,23(5):700-704.

[12]全杜鹃,魏岩,严成.4种一年生藜科植物幼苗的生长动态[J].新疆农业大学学报,2011,34(6):465-468.

[13]杨红兵,周亚明,刘浩,等.六种藜科植物提取物对植物病原菌的抑制活性 [J].天然产物研究与开发,2009,21(5):744-747.

[14]Wu S B,Wu J,Yin Z W,et al.Bioactive and marker compounds from two edible dark-colored Myrciaria fruits and the synthesis of jaboticabin[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2013,61(17):4035-4043.

[15]赵芳,王自军,宋丽,等.荨麻多酚抗氧化性质的研究[J].石河子大学学报:自然科学版,2008,26(2):164-166.

[16]尹震花,王佳佳,顾海鹏,等.黑莓（萨尼）果实体外抗氧化活性研究[J].天然产物研究与开发,2013,25(4):530-532.

[17]Ruan Z P,Zhang L L,Lin Y M.Evaluation of the antioxidant activity of Syzygium cumini leaves[J].Molecules,2008,13(10):2545-2556.

[18]Toure A,Xu X,Michel T,et al.In vitro antioxidant and radical scavenging of Guinean kinkeliba leaf（Combretum micranthum G.Don）extracts[J].Natural Product Research,2011,25(11):1025-1036.

[19]吴雪辉,张喜梅,李廷群,等.板栗花粗提物的抗氧化活性研究[J].现代食品科技,2008,24(1):14-19.

[20]赵芳,王自军,宋丽,等.荨麻多酚抗氧化性质的研究[J].石河子大学学报:自然科学版,2008,26(2):164-166.