茶槲寄生“螃蟹脚”中黄酮醇及黄烷醇类化合物的分析

倪婷婷，李 璐，赵 明，邵宛芳，李家华

云南农业大学龙润普洱茶学院，昆明650201

茶槲寄生“螃蟹脚”系桑寄生科槲寄生属(Viscum articulatum Burm)［1］植物，是一种寄生在树龄较老的古乔木茶树上的寄生植物，为多年生草本，形状像小珊瑚，因寄生枝杆节状带亳像螃蟹，故此被称为“螃蟹脚”。在世界茶树起源中心地—云南普洱、西双版纳等地区，由于其特殊的地理位置和生态环境，古茶园的古茶树上就寄生着“螃蟹脚”。据《中华人民共和国药典》记载，槲寄生 Viscum coloratum(Kom.)Nakai 作为我国传统中药，以干燥的带叶茎枝入药，其性凉，微酸微苦、平，归肝、肾经，有祛风除湿、补肾安胎、强筋壮骨等功效［2］。现代医学研究还表明，槲寄生具有降压、护心(抗心率失常和改善心脏微循环、抗心肌缺氧)、抗肿瘤(有细胞毒性，欧洲传统视为肿瘤药物，在欧洲桑寄生科植物药是晚期癌症保守疗法的主药)等作用［3，4］。“螃蟹脚”作为槲寄生属植物，与槲寄生 Viscum coloratum(Kom.)Nakai 具有同等功效［1］。

近年来，对槲寄生属的研究发展较快，国内已对寄生在柿、栗、榆、桦、柳、枫、杨等树上的有报道和专利［5，6］。已有研究表明，槲寄生属植物的主要功能成分为黄酮类化合物、生物碱、三萜及甾醇类和一些高分子化合物［7］。与上述植物的槲寄生属植物相比，茶槲寄生“螃蟹脚”由于主要寄生在古茶树上，一直以来都没有得到人类的认识和利用，只是随着古树普洱茶热的兴起，寄生在古茶树上的“螃蟹脚”被古茶区人民发现并作为饮料利用后，才逐渐被世人认识。本文采用HPLC 法对“螃蟹脚”的多酚类化合物中的黄酮醇及黄烷醇类物质的组成进行了定性分析，并采用三氯化铝比色法、酒石酸铁法测定了“螃蟹脚”黄酮类化合物和茶多酚的总含量，HPLC法定量分析了杨梅素、槲皮素和山柰酚的含量，旨在为以后对其单体成分的提取、药理作用及分子生物学等方面的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

“螃蟹脚”(Viscum articulatum Burm)采自云南省普洱市澜沧拉祜族自治县的景迈万亩古茶园的古茶树上，样品经日光晒干后置于冰箱(-20 ℃)保存。槲皮素标准样、山奈酚标准样(中国药品生物制品检定所，纯度分别是:96.5%和95.9%);杨梅素标准样(Sigma-Aldrich 公司，纯度≥96.0%);甲醇、乙氰为色谱纯，水为超纯水，磷酸为分析纯，盐酸为分析纯(浓度36%～38%)，丙酮为分析纯(浓度≥99.5%);儿茶素标准样:表没食子儿茶素(EGC，纯度99.8%)，表儿茶素(EC，纯度99.8%)，表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG，纯度98%)，表儿茶素没食子酸酯(ECG，纯度98.9%)，标样购于Dr.Ehrenstorfer 公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪(HPLC)分析装置:美国Agilent 1200 型高效液相色谱系统(UV 检测器:Agilent 1200VWD G1314B;柱温箱:Agilent 1100/1200 G1316A;进样器:Agilent 1100/1200 温控自动进样器G1329A;脱气机:Agilent 1100/1200 G1322A;溶剂输送泵:Agilent 1100/1200 四元泵G1311A);TSK gel ODS-80TM色谱柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm，日本Tosoh 公司);电子天平(型号:CP214，奥豪斯仪器(上海)有限公司);微型植物试样粉碎机(型号:FZ102，北京市永光明医疗仪器厂);紫外可见分光光度计(型号:756CRT，上海箐华科技仪器有限公司);0.45 μm 有机系微孔滤膜(天津市腾达过滤器件厂);电热恒温水浴锅(上海精密仪器仪表厂);回流装置(自制)。

1.3 方法

1.3.1 黄酮醇类物质标准液的制备

分别精密称取杨梅素、槲皮素和山柰酚对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含0.3 mg 的溶液，

作为对照品溶液。

1.3.2 黄烷醇类物质混合标准液的制备

分别称取4 种主要儿茶素标准样5.0 mg 于50 mL 棕色容量瓶中加入50 mL 70%甲醇溶液溶解混匀，作为混合标准样溶液保存备用。

1.3.3 黄酮醇类物质HPLC 分析用“螃蟹脚”样品供试溶液的制备

植物中的黄酮类物质主要以水溶性的黄酮苷为主，但是黄酮苷的种类繁多，标准品数量太少，不利于分析。因此需要先将其水解为苷元来测定。本文参照文献［8］，用水浴加热回流装置制备供试品溶液。精确称取“螃蟹脚”粉末1.00 g，加甲醇40 mL，盐酸分析纯(浓度36%～38%)4 mL，置于圆底烧瓶中回流水解1.5 h(85 ℃)，过滤，滤液置50 mL 容量瓶，用少许甲醇洗涤残渣及容器，洗涤液并入容量瓶中，加甲醇定容至50 mL，摇匀，经0.45 μm 有机系微孔滤膜过滤后进行色谱分析。

1.3.4 黄烷醇类物质HPLC 分析用“螃蟹脚”样品供试溶液的制备

准确称取“螃蟹脚”粉末1. 00 g，加入30 mL 80%丙酮溶液，室温静置24 h，重复3 次。合并3 次浸提液用滤纸过滤，滤液经减压旋转蒸发仪浓缩除去丙酮，浓缩液中加入70%甲醇水溶液定容至50 mL，摇匀，供试液经0.45 μm 有机系微孔滤膜过滤后进行色谱分析［9］。

1.3.5 茶多酚总含量的测定

酒石酸铁比色法(国标GB/T8315)［10］。

1.3.6 黄酮类化合物总含量的测定

黄酮按参考文献1 的方法提取，即称取“螃蟹脚”样品粉末1.00 g，在60 ℃条件下以45%乙醇为提取溶剂，固液比1:5(即加入45%乙醇5 mL)，回流提取3 次，2 h/次。3 次提取液合并至25 mL 容量瓶中，并用45%的乙醇定容至刻度，作为供试品溶液［1］。含量测定用三氯化铝比色法［11］。

1.3.7 HPLC 分析条件

1.3.7.1 黄酮醇类物质的HPLC 分析条件

色谱柱:TSK gel ODS-80TM色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm，日本Tosoh 公司)。流动相:A 相:0.2%磷酸水溶液;B 相:80%甲醇。梯度从30%B到80%B，流速0.8 mL/min，55 min 内完成，检出波长360 nm，柱温40 ℃，进样量10 μL，每次完成后系统平衡10 min 后再次进样［8］。

1.3.7.2 黄烷醇类物质的HPLC 分析条件

色谱柱:TSK gel ODS-80TM色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm，日本Tosoh 公司)。流动相:A 相:(0. 05M H3PO4-H2O)-5% CH3CN;B 相:(0. 05M H3PO4-H2O)-80%CH3CN;梯度从9%B 到53%B，流速0.7 mL/min，55 min 内完成，检出波长280 nm，进样量10 μL，每次完成后系统平衡15 min 后再次进样［12］。

1.3.8 结果计算

“螃蟹脚”样品中黄酮醇苷元含量的计算式见下式［8］。

式中Wa，b，c为试样中杨梅素(a)、槲皮素(b)和山柰酚(c)检出峰的含量，单位:mg/g;C1，2，3为标准曲线上杨梅素(1)、槲皮素(2)和山柰酚(3)检出峰的浓度，单位:mg/mL;V 为样品定容体积，单位:mL;M 为试料的质量，单位:g。

2 结果与分析

2.1 HPLC 分析方法的评价

2.1.1 精密度、准确度及最低定量值

分别进样杨梅素、槲皮素和山柰酚系列标准使用液(0.06、0.12、0.18、0.24、0.3 mg/mL)，按1.3.7.1 中的色谱分析条件进样分析。以浓度(mg/mL)为X，峰面积为Y，计算得杨梅素、槲皮素及山柰酚的回归方程。以信噪声比S/N =3 计算最低检出量(LOD)和最低定量值(LOQ)。分别进样分析上述3种标准使用液，计算5 次分析峰面积的相对标准偏差。上述分析结果见表1。

表1 杨梅素、槲皮素和山奈酚的标准曲线、检出量和相对标准偏差Table 1 Standard curve，LOD-LOQ and RSD of myricetin，quercetin and kaempferol

2.1.2 稳定性

取“螃蟹脚”的供试样品溶液，分别与0、4、8、12、24 h 进样测定峰面积，结果杨梅素、槲皮素和山柰酚的RSD 均小于2.0%，表明供试样品24 h 内稳定性好。

图1 杨梅素、槲皮素和山柰酚标样及“螃蟹脚”中黄酮醇类物质的HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of (A)myricetin，quercetin and kaempferol standards，(B)V.articulatum Burm sample

考察最低检出量和最低定量值、HPLC 的精密度、稳定性及建立的标准曲线，可以认为此方法能较好的对黄酮醇进行定性定量分析。

2.2 “螃蟹脚”中黄酮醇类物质的组成与含量

2.2.1 “螃蟹脚”中黄酮醇类物质的组成

图1(A)是杨梅素、槲皮素和山柰酚标样的HPLC 色谱图，从图1(A)可以看出，在选定的分析条件下，杨梅素、槲皮素和山柰酚分别在15. 624、18.233 min 和21.735 min 内实现了良好的分离。

图1(B)是“螃蟹脚”经1.3.3 的方法处理后，HPLC 检测到的黄酮醇类物质组成的情况。从图可知，“螃蟹脚”中检测到了峰面积较大的9 个组分，其中，保留时间为15.450 min(峰6)的组分通过在线VWD 紫外-可见光谱扫描与杨梅素标样有相同的吸收光谱，保留时间与杨梅素标样的保留时间(15.624 min)近乎一至，由此可以判断“螃蟹脚”中含有杨梅素;另外，峰7(18.679 min)和峰8(21.745 min)的保留时间与槲皮素和山奈酚标样的保留时间相似，初步判断“螃蟹脚”中含有槲皮素和山奈酚。其余分别在保留时间为2.868 min(1)、6.643 min(2)、7.785 min(3)、8.429 min(4)、9.811 min(5)和22.951 min(9)时检测到的峰面积较大的6个未知组分的成分还有待进一步的研究。

2.2.2 “螃蟹脚”中杨梅素、槲皮素、山奈酚及黄酮类化合物的含量

表2 为“螃蟹脚”中杨梅素、槲皮素、山奈酚HPLC 定量分析和黄酮类化合物总含量的测定结果。从表2 可知，“螃蟹脚”中黄酮醇类物质的含量相对较少，已知的杨梅素、槲皮素和山奈酚三种单体成分中杨梅素的含量为0.16 mg/g，远高于其余两类的含量。本文参照文献1 提取“螃蟹脚”中黄酮类化合物的最佳提取条件和方法，提取了“螃蟹脚”中黄酮类化合物，采用三氯化铝比色法测定了其总含量，从结果可看出，“螃蟹脚”中总黄酮含量达7.65 mg/g。

表2 “螃蟹脚”中杨梅素、槲皮素、山奈酚及黄酮类化合物的总含量Table 2 The concentrations of myricetin，Quercetin and kaempferol and flavonoids in Viscum articulatum Burm

2.3 “螃蟹脚”中黄烷醇类物质的组成及总多酚含量

“螃蟹脚”寄生在多年生的古茶树上，而茶叶富含黄烷醇类物质，为了明确作为茶树寄生植物的“螃蟹脚”中是否含有黄烷醇类物质，本文以茶叶中含量最多的4 种主要儿茶素为标样，用HPLC 法检测了“螃蟹脚”的黄烷醇类物质。图3(a)是4 种茶叶中主要的黄烷醇类物质:表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)混合标样的HPLC 色谱图;图3(b)是“螃蟹脚”黄烷醇类物质组成的HPLC 色谱图;图3(c)是“螃蟹脚”供试液中加入上述4 种儿茶素混标后的HPLC 色谱图。由图3 可知:“螃蟹脚”样品含有与EGC、EGCG 和ECG保留值相似的组分，且加入混标后，3 个组分的峰高与峰面积增大，初步表明“螃蟹脚”中可能含有该3种儿茶素。但是，通过酒石酸铁比色法所测得的“螃蟹脚”中多酚类物质的总含量仅为0.84%，含量远低于茶叶中多酚类物质的含量。

图2 4 种主要儿茶素及“螃蟹脚”中黄烷醇类物质的HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of four catechins (EGC，EC，EGCG and ECG)(a)，flavanols of V. articulatum Burm (b)，and mixture of four catechins (EGC，EC，EGCG and ECG)and flavanols (c).

3 讨论

“螃蟹脚”是在上百年的古茶树才能找得到的一种寄生植物，目前由于过量采摘，野生数量已极为稀少，而且因其在野生状态下生长极为缓慢，其资源也面临着危机，因此，利用现代的分析手段对其功效成分的研究显得尤为重要。但是由于受“螃蟹脚”寄主植物特殊性的影响，材料的获得与收集具有一定的困难，导致对其内含成分的研究相对匮乏，目前仅有杨凤贤等对其黄酮类化合物的提取工艺作了研究。基于此研究现状，本文应用HPLC 法对“螃蟹脚”中黄酮醇类物质的组分与含量，黄烷醇类(儿茶素)的组分进行了分析研究，从“螃蟹脚”中检测到了包括杨梅素、槲皮素、山柰酚在内的9 个(图1B)黄酮醇类物质的组分和包括EGC、EGCG、ECG 在内的黄烷醇类(儿茶素)组分。另外，通过HPLC 定量分析，“螃蟹脚”样品中杨梅素、槲皮素和山柰酚的含量分别为:0.16、0.03 和0.05 mg/g;通过三氯化铝比色法测定“螃蟹脚”样品中黄酮类化合物的总含量为7.65 mg/g;酒石酸铁法测定“螃蟹脚”样品中茶多酚的含量仅为0.84%，远低于茶叶中茶多酚的含量。上述研究结果在一定程度上为今后进一步深入开展“螃蟹脚”中黄酮醇及黄烷醇类(儿茶素)物质单体成分的提取分离及化学结构式的鉴定研究、构效关系的研究等提供了参考和理论依据。

1 Yang FX(杨凤贤)，Xiang YB(向轶波)，Feng XF(冯小飞)，et al. Study on optimum extraction processes of flavonoids from Viscum articulatum Burm.Lishizhen Med Materia Med Res (时珍国医国药)，2009，20:1072-1074.

2 Chinese Pharmacopoeia Commission(国家药典委员会).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(中华人民共和国药典). Beijing:China Medical Science Press，2010，Vol I:350.

3 Guo YJ(郭艳杰)，Zhou LS(周立社).槲寄生药理作用研究进展.J Baotou Med College (包头医学院学报)，2008，24:106-108.

4 Kong YQ(孙艳秋)，Liu K(刘珂)，Wang SY(王守愚)，et al.槲寄生的研究进展.Chin Tradit Herb Drugs (中草药)，2000，31(6):73-76.

5 Zhao QY(赵启友)，Wang XL(王晓林)，Zhang H(张浩)，et al.Pharmacognostic identification on crude drug of Viscum articula tum Burm.F.Nat Prod Res Dev (天然产物研究与开发)，1998，11(5):46-50.

6 Tao MX(陶明煊)，Wu GR(吴国荣).The research and development of Viscum coloratum(Kom.)Nakai. Chin Wild Plant Res (中国野生植物资源)，2001，20:l4-15.

7 Zhang SX(张水仙)，Liu Y(刘越)，Sun HB(孙洪波)，et al.槲寄生化学成分及药理作用研究进展. J Chin Med Mat(中药材)，2011，34:1962-1966.

8 Li JH(李家华)，Zhao M(赵明)，Zhang GH(张广辉)，et al.HPLC analysis of myricetin，quercetin and kaempferol in fresh shoots of“zijuan”tea，a new cultivar of Camella sinensis var.assamica. J Yunnan Agric Univ，Nat Sci(云南农业大学学报，自科版)，2012，27:235-240.

9 Li JH(李家华)，Zhang GH(张广辉)，Shao WF(邵宛芳)，et al. Hereditary analysis of tea ployphenols in Camellia sinensis F1hybrids based on principal component and cluster analysis.Mol Plant Breed(分子植物育种)，2011，9:491-497.

10 Huang YH(黄意欢). 茶学实验技术. 茶叶茶多酚类测定I.Beijing:China Agriculture Press，1997.115-117.

11 Huang YH(黄意欢). 茶学实验技术. 黄酮类化合物总量的测定.Beijing:China Agriculture Press，1997.124-125.

12 Li JH，Nesumi AS，Shimizi KC，et al.Chemosystematics of tea trees based on tea leaf polyphenols as phonetic markers.Phytochemistry，2010，71:1342-1349.