蚕蛹复合氨基酸对人肝癌细胞SMMC-7721 的抑制作用

湛孝东，施自伦，李朝品，*

1皖南医学院，芜湖241002;2 安徽理工大学医学院，淮南232001

蚕蛹营养丰富，蛋白质含量高，占鲜蛹的14%～15%，占干蛹的59.9%～66.2%［1］。蚕蛹蛋白水解后得到的复合氨基酸(CAASCP)含有人体生长发育所需的18 种氨基酸，其中8 种人体必需氨基酸含量高，用途十分广泛［2］。现代药理学研究表明，蚕蛹复合氨基酸具有提高免疫机能作用［3］、减少脂肪合成［4］、保护肝脏作用［5］、营养保健促进创口愈合作用［6，7］及抗氧化和降血压作用［8］，但蚕蛹复合氨基酸抗肿瘤作用报道极少。有研究表明蚕蛹复合氨基酸对S180、HepA 荷瘤小鼠的瘤体有明显的抑制作用［9］。

肝细胞癌为常见肿瘤，死亡率高，生存期短，多数患者就诊时已进入晚期，不宜手术切除。探讨有效的药物治疗手段十分必要。肿瘤的发生发展都与细胞凋亡密切相关，诱导细胞凋亡已成为治疗肿瘤的热点和关键。本实验选用人肝癌细胞SMMC-7721，观察蚕蛹复合氨基酸对其抑制作用及在体外诱导人肝癌细胞株HepG2 凋亡的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蚕蛹复合氨基酸(由湖州新天丝生物技术有限公司提供);人正常肝细胞株QSG-7701(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心);人肝癌SMMC-7721 细胞株(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心);RPMI-1640 培养液(上海钰森生物技术有限公司);胎牛血清(杭州四季青生物公司);噻唑蓝(MTT)、Annexin V-FITC、碘化吡啶(PI)、Hoechst33258、二甲基亚砜(DMSO)、Triton X-100、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、RNA 酶(均购自Sigma 公司)。

1.2 仪器

IX71FL 研究级倒置荧光显微镜(日本Olympus公司);Eipcs XL 型流式细胞仪(美国Bec km an-Coulter 公司);Anthos lucy2 酶标仪(奥地利ANTHOS 公司);MCO-15AC CO2培养箱(日本三洋电子有限公司);高速冷冻离心机(德国Eppendorf 公司);SW-CJ-2A 净化工作台(吴江市新长城空调净化有限公司);ZD-9556 摇床(金坛市盛蓝仪器制造有限公司);AE-20 电子分析天平(瑞士Metller 公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 蚕蛹复合氨基酸对正常肝细胞株的药物毒性实验

取适量冻存人正常肝细胞QSG-7701 复苏，放于25 cm2细胞培养瓶中，加入RPMI-1640 培养液(含10%胎牛血清，青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL)，在37 ℃，5% CO2饱和湿度的培养箱中培养、传代。每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。每隔3d 传代一次，传至5 代后消化、收集对数生长期的QSG-7701 细胞，并调整浓度为4 ×104个/mL 的单细胞悬液，接种于96 孔培养板，每孔100 μL，37 ℃培养24 h 待细胞贴壁后，吸弃细胞培养液，加入不同浓度蚕蛹复合氨基酸(100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001 mg/mL)的RPMI-1640 培养液，同时设立空白对照组(只加培养液)，细胞对照组(只加细胞和培养液)，每组设5 个复孔，培养48 h 后，每孔加MTT(5 mg/mL)20 μL 继续培养4 h，吸弃上清液，150 μL/孔加入DMSO 溶液，室温震荡10 min。用酶标仪测量吸光度(OD 值)，检测波长为490 nm。计算细胞存活率和最大无毒浓度TC0。一般认为在药物作用下若细胞存活率＞95%，此药物浓度即为TC0，对培养细胞无毒性，为药物作用的安全浓度［9］。

1.3.2 蚕蛹复合氨基酸对人肝癌细胞株SMMC-7721 的抑制作用

1.3.2.1 蚕蛹复合氨基酸对SMMC-7721 增殖的影响

按照药物毒性实验中的方法将人肝癌细胞株SMMC-7721 复苏，实验组加入不同浓度蚕蛹复合氨基酸，分别培养24、48、72 h 后检测OD 值。计算细胞抑制率和半数抑制浓度(IC50)。

1.3.2.2 细胞凋亡率检测

将洁净盖玻片置于6 孔板内，每孔接种5 ×105个/mL 的SMMC-7721 细胞悬液1 mL，37 ℃、5%CO2条件下培养24 h，使盖玻片上铺满细胞达80%以上。实验分组:对照组(给予RPMI-1640 培养液);不同氨基酸浓度组。分别加入2 mL，继续培养48 h。弃上清液，以冷PBS(pH 7.2)洗3 遍，用0.5 mL 甲醇/冰乙酸(3∶1)在4 ℃固定5 min，吸弃固定液后，以PBS 洗3 遍，室温干燥后用Hoechst33258(10 mg/L)染色，室温避光30 min，PBS 清洗，干燥，封片。荧光显微镜下观察并拍照后计算细胞的凋亡率。同一处理组随机选择5 个观察视野，每个视野计数100 个细胞，计数凋亡细胞数，并计算细胞凋亡率，取5 次结果的平均值。荧光显微镜下正常细胞核呈弥散均匀的荧光，凋亡细胞核呈团状或碎块状致密浓染的强荧光。

1.3.2.3 流式细胞术测定蚕蛹复合氨基酸对肝癌细胞周期的影响

按细胞凋亡检测的方法加药培养、洗涤SMMC-7721 细胞后，离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4 ℃固定保存过夜。离心弃去固定液，3 mL PBS 重悬5 min。300 目的筛网过滤1 次，500～1000 rpm 离心5 min，弃去PBS。用0.5 mL PI 染液染色，室温避光染色30 min。流式细胞术检测细胞周期。

1.3.2.4 流式细胞术测定细胞凋亡

按细胞凋亡检测的方法加药培养、洗涤SMMC-7721 细胞后，用1 ×Binding Buffer 重悬，将细胞浓度调整为1 ×106个/mL。取500 μL 细胞悬液于EP管中。加入5 μL AnnexinV-FITC 和10 μL PI，室温下避光孵育30 min，1 h 内上流式细胞仪检测。

1.4 统计学方法

应用SPSS11.5 统计软件进行数据处理，数据采用均数和标准差来描述。两样本均数比较采用方差检验，选择P ＜0.05 作为具有显著性差异的标准。IC50通过SPSS11.5 统计软件算出。

2 结果

2.1 蚕蛹复合氨基酸对正常肝细胞株QSG-7701的药物毒性实验结果

不同浓度的蚕蛹复合氨基酸对正常肝细胞株QSG-7701 的毒性作用见表1。

表1 蚕蛹复合氨基酸对正常肝细胞株QSG-7701 的毒性作用Table 1 Cytotoxicity of CAASCP against QSG-7701 cell strain

从表1 可以看出，当蚕蛹复合氨基酸的浓度为10 mg/mL 时，细胞存活率＞95%，即TC0=10 mg/mL，可以认为蚕蛹复合氨基酸在此浓度下对正常肝细胞株QSG-7701 基本无毒性。因此实验中蚕蛹复合氨基酸的浓度分别设为10、1、0.1、0. 01、0. 001 mg/mL。

2.2 MTT 法检测蚕蛹复合氨基酸对SMMC-7721 增殖的影响

不同浓度蚕蛹复合氨基酸分别作用24 、48 、72 h 后对SMMC-7721 增殖的抑制率见表2。

表2 不同浓度蚕蛹复合氨基酸分别作用24 h、48 h、72 h 后对SMMC-7721 增殖的抑制率(%，±s)Table 2 Inhibition rates of SMMC-7721 cell strain with different concentrations of CAASCP after 24 h，48 h，72 h culturing (%，±s)

表2 不同浓度蚕蛹复合氨基酸分别作用24 h、48 h、72 h 后对SMMC-7721 增殖的抑制率(%，±s)Table 2 Inhibition rates of SMMC-7721 cell strain with different concentrations of CAASCP after 24 h，48 h，72 h culturing (%，±s)

注:与对照组比较，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compare with cell group，* P ＜0.05 ，＊＊P ＜0.01.

组别Group剂量Concentration(mg/mL)24 h 48 h 72 h OD 值OD values抑制率Inhibition rates OD 值OD values抑制率Inhibition rates OD 值OD values抑制率Inhibition rates空白对照(Blank group - 0.102 ±0.011 - 0.105 ±0.059 - 0.107 ±0.011 -细胞对照(Cell group) - 0.569 ±0.044 - 1.087 ±0.048 - 1.205 ±0.034 -药物组Drug group 0.001 0.527 ±0.021 9.0 0.965 ±0.031＊＊ 12.4 1.021 ±0.032＊＊ 16.8 0.01 0.504 ±0.018* 13.9 0.916 ±0.057＊＊ 17.4 0.945 ±0.032＊＊ 23.7 0.1 0.468 ±0.023＊＊ 21.6 0.799 ±0.034＊＊ 29.3 0.804 ±0.022＊＊ 36.5 1 0.357 ±0.030＊＊ 45.4 0.594 ±0.025＊＊ 50.2 0.562 ±0.044＊＊ 58.6 10 0.319 ±0.039＊＊ 53.5 0.464 ±0.031＊＊ 63.4 0.432 ±0.025＊＊70.4

由表2 可得出，不同浓度的蚕蛹复合氨基酸(10、1、0.1、0.01、0.001 mg/mL)作用SMMC-7721细胞24、48 h 和72 h 后，各用药组的细胞生长抑制率分 别 为9. 0%～53. 5%、12. 4%～63. 4% 和16.8%～70.4%。蚕蛹蛋白复合氨基酸对SMMC-7721 细胞有较强的抑制作用，各组与细胞对照组相比，吸光度值的差异有显著性(P ＜0.05)，同时显示出对剂量和时间的依赖性，即在同一作用时间内，药物浓度增加，细胞生长抑制率增加;同一药物浓度下，作用时间越长，细胞生长抑制率越高。作用24、48、72 h 后，蚕蛹蛋白复合氨基酸对SMMC-7721 细胞的IC50分别为4.691、1.469 和0.451 mg/mL。

2.3 细胞凋亡率检测结果

不同浓度蚕蛹蛋白复合氨基酸作用SMMC-7721 细胞48 h，经Hoechst33258 染色法对其进行染色后，荧光显微镜下观察，结果见图1。在荧光显微镜下，活细胞核呈弥散、均匀荧光，坏死细胞不被Hoechst 染色。出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状蓝色荧光及明显核形态变化，如果见到3 个或3 个以上的DNA 荧光碎片被认为是凋亡细胞。不同浓度蚕蛹蛋白复合氨基酸作用48 h 后SMMC-7721 细胞的凋亡率见表3。

图1 不同浓度蚕蛹蛋白复合氨基酸作用SMMC-7721 后的染色结果Fig.1 Dyeing results of SMMC-7721 with different concentrations of CAASCP

表3 不同浓度蚕蛹蛋白复合氨基酸作用48 h 后SMMC-7721 细胞的凋亡率Table 3 Apoptosis rate of SMMC-7721 with different concentrations of CAASCP after 48 h culturing

正常对照组细胞凋亡率为2.33%;0.001 mg/mL 浓度组的细胞凋亡率为3.32%;0.01 mg/mL 浓度组的细胞凋亡率为6.73%;0.1 mg/mL 浓度组的细胞凋亡率为13.66%;1 mg/mL 浓度组的细胞凋亡率为22.89%;10 mg/mL 浓度组的细胞凋亡率为31.21%。随着蚕蛹蛋白复合氨基酸浓度的不断增大，细胞凋亡率亦不断增大，且与细胞对照组相比，差异有显著性。

2.4 蚕蛹蛋白复合氨基酸作用后SMMC-7721 细胞的周期变化

经PI 染色后，利用流式细胞术检测蚕蛹蛋白复合氨基酸对肝癌细胞SMMC-7721 的细胞周期分布的影响，结果见表4。

表4 蚕蛹蛋白复合氨基酸对人肝癌SMMC-7721 细胞周期分布的影响Table 4 Effect of CAASCP on cell cycle distribution of human hepatocarcinoma SMMC-7721 cell strain

由表4 可得出，正常生长的细胞对照组G0/G1期、S 期和G2/M 期细胞所占比例分别为48. 6%、42.3%和9.1%。不同浓度蚕蛹蛋白复合氨基酸作用SMMC-7721 细胞48 h 后，各给药组G0/G1期和S期细胞所占比例出现不同程度的降低，而G2/M 期细胞则出现不同程度的升高，其中以10 mg/mL 浓度组升高的最多，为42.1%。实验表明蚕蛹蛋白复合氨基酸能够将人肝癌细胞株SMMC-7721 细胞阻滞在细胞的G2/M 期，并能诱导其凋亡。

2.5 蚕蛹蛋白复合氨基酸作用后SMMC-7721 细胞的凋亡变化

不同浓度蚕蛹蛋白复合氨基酸作用SMMC-7721 细胞48 h 后，检测细胞凋亡情况。用FlowJo 5.0 软件分析流式细胞仪检测的图像，其中第一象限为坏死细胞，第二象限为晚期凋亡细胞，第三象限为活细胞，第四象限为早期凋亡细胞。结果见图2。不同浓度蚕蛹蛋白复合氨基酸作用SMMC-7721 细胞后的细胞凋亡和坏死率的变化见表5。

由图2、表5 可见，细胞对照组的凋亡和坏死细胞占7%，0.001 mg/mL 浓度组的凋亡和坏死细胞占11.75%，0.01 mg/mL 浓度组的凋亡和坏死细胞占25.84%，0.1 mg/mL 浓度组的凋亡和坏死细胞占38.17%，1 mg/mL 浓度组的凋亡和坏死细胞占47.90%，10 mg/mL 浓度组的凋亡和坏死细胞占51.63%。随着蚕蛹蛋白复合氨基酸浓度的增加，凋亡和坏死细胞占的比率也增大，呈现一定的剂量依赖性。结果表明，蚕蛹复合氨基酸在体外能够明显的促进SMMC-7721 细胞株的凋亡和坏死。

3 讨论

本实验选取正常肝脏细胞QSG-7701 为对照细胞，通过药物毒性实验筛选出对正常肝脏细胞基本无毒的蚕蛹蛋白复合氨基酸的浓度，用此浓度的蚕蛹蛋白复合氨基酸去体外作用于肝癌细胞SMMC-7721，以此来研究其在体外的抗肝癌细胞的作用。蚕蛹复合氨基酸在浓度低时对正常细胞具有营养作用，故避免了因为浓度过大而引起对正常肝脏细胞的损害，对肝癌细胞具有抑制作用的同时对正常细胞提供营养，促进其生长［10］。以上实验表明，蚕蛹复合氨基酸对肝癌SMMC-7721 细胞株具有较强的抑制作用。

图2 不同浓度蚕蛹蛋白复合氨基酸作用SMMC-7721 后的细胞凋亡和坏死情况Fig.2 Apoptosis images of SMMC-7721 with different concentrations of CAASCP

表5 不同浓度蚕蛹蛋白复合氨基酸作用SMMC-7721 后的细胞凋亡和坏死率的变化Table 5 The apoptosis and necrosis rates of SMMC-7721 cell strain with different concentrations of CAASCP

流式细胞仪是目前国际公认的最客观的凋亡检测指标之一，尤其在用于定量分析和细胞周期分析时更为有效［11］。细胞凋亡时，流式细胞检测可呈现亚二倍体核型峰的特征，也就是说，用DNA 结合染料PI 嵌入重叠的DNA 中，流式仪检测DNA 含量低于正常二倍体的细胞就是亚二倍体细胞，也就是凋亡细胞，因而在DNA 直方图上凋亡细胞出现二倍体峰(G1细胞)的减少，G1峰左侧出现亚二倍体细胞群的峰型(Sub-G1)［12］。在我们研究凋亡细胞周期分析发现，蚕蛹复合氨基酸能阻滞肝癌细胞SMMC-7721 的细胞周期于G2/M 期，使G2/M 期细胞比例增加，而G0/G1期和S 期细胞比例下降，说明所制备的蚕蛹复合氨基酸溶液能够将肝癌细胞SMMC-7721 阻滞在细胞的G2/M 期，具有抑制肝癌细胞的功能并能诱导其凋亡，这与国内学者的报道一致［13］。

本研究证实了蚕蛹复合氨基酸对肝癌SMMC-7721 细胞株具有一定的抑制作用，为蚕蛹复合氨基酸的药效提供了理论支持，也为蚕蛹的综合利用开辟了新途径。但本研究只是在体外观察了蚕蛹蛋白复合氨基酸对肝癌SMMC-7721 细胞株的抑制作用，还需体内实验的验证。另外蚕蛹蛋白复合氨基酸的成分复杂，具体的抗癌成分也有待进一步分析。

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