响应面法优化超声辅助提取太子参多糖工艺研究

林志娟，陈 永* ，尤丽彤，孙凤祥，李桂芝

1潍坊医学院基础医学院;2 潍坊医学院2008 级药学专业，潍坊261053

太子参，又名孩儿参、童参，为石竹科多年生植物异叶假繁缕［Pseudostellaria hetero phylla (Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.］的块根，具有益气健脾、生津润肺之功效，临床常用于脾虚体倦、食欲不振、病后虚弱、气阴不足。实验研究表明太子参多糖是其主要药物活性成分之一，具有抗疲劳、抗应激和增强机体免疫功能等作用［1，2］，同时对由四氧嘧啶导致的糖尿病小鼠具有显著治疗作用［3］，具有较高的开发和应用价值。然而，目前关于太子参多糖提取方法工艺的研究相对较少。

超声波提取是利用超声波具有的机械效应、空化效应及热效应，通过增大介质分子的运动速度，增大介质的穿透力以提取天然产物有效成分的方法。具有提取时间短、提取效率高等优点［4］。

目前，多糖提取工艺优化多为均匀设计和正交设计，此类方法不能考察因素之间的相互作用，同时也很难考察多个响应值与因素之间的交互作用关系。响应面分析法(response surface methodology，RSM)是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法。通过局部实验回归拟合因素与结果间的全局函数关系，从而得到准确有效的实验结论，能在整个考察区域上确定各个因素的最佳组合及最优响应值。响应曲面法以其试验次数少周期短，求得的回归方程精度高，能研究几种因素间交互作用的诸多优点［5］，现已广泛应用于工艺条件优化等领域。本研究在单因素试验的基础上，采用响应曲面法进一步优化太子参多糖超声辅助提取工艺，以期得到最佳提取工艺参数，为太子参多糖的进一步开发利用提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

太子参，购自潍坊本草阁大药房，60 ℃烘干，粉碎，过100 目筛。浓硫酸、苯酚、葡萄糖、三氯甲烷、正丁醇均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

WKX-230 风选中药粉碎机:山东青州市精诚机械制造有限公司;KQ-100DB 型数控超声清洗器:昆山市超声仪器有限公司;HC-3018 高速离心机:安徽中科中佳科学仪器有限公司;722S 可见分光光度计:上海棱光技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 太子参多糖提取工艺

准确称取太子参粉10 g，按比例加入蒸馏水浸泡3 h，按试验设计进行超声浸提。提取液70 ℃减压浓缩，离心除去沉淀，Sevage 法脱蛋白3 次，蒸馏水透析24 h，然后加入3 倍体积无水乙醇沉淀过夜，离心，沉淀用无水乙醇、丙酮洗涤，干燥后得太子参多糖。

1.3.2 葡萄糖标准曲线的制备—苯酚硫酸法［6］

精密称取105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖100 mg，定容至1000 mL，摇匀即得0.10 mg/mL 的葡萄糖溶液，作为标准溶液。精密量取葡萄糖标准溶液0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mL 分别置于具塞试管中，分别加水至0.5 mL，空白对照为蒸馏水0.5 mL，各加5 %苯酚(重蒸)溶液0.5 mL，混匀，加浓硫酸2.5 mL，迅速振摇混匀，于室温下放置30 min，490 nm 处比色，以吸光度(A)为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.3 多糖测定及提取得率计算

精密称取干燥至恒重的太子参多糖样品10 mg溶于适量蒸馏水中，100 mL 容量瓶定容，既得0.1 mg/mL 多糖溶液。吸取多糖溶液0.5 mL 至具塞试管中，苯酚-硫酸法测定多糖含量，按多糖提取得率(% )= (多糖质量/样品质量)×100 %计算太子参多糖提取得率。

1.3.4 多糖提取的单因素试验

以提取时间45 min，提取温度70 ℃，超声波功率80%，液料比20∶1 为基本条件，分别考察超声波功率、提取时间、提取温度及水料比各单因素变化对多糖提取得率的影响。

1.3.5 响应面法优化试验设计

在单因素试验基础上，采用Box-Behnken 试验设计方案［7-9］，进一步优化超声法提取太子参多糖的条件。试验以太子参多糖提取得率为响应值(Y)，分别用X1、X2、X3表示提取温度、提取时间和水料比3 个自变量，并以-1、0、1 分别表示3 个水平，按方程xi=(Xi-X0)/△X 对自变量进行编码。式中:xi为自变量的编码值;Xi为自变量的真实值;X0为试验中心点处自变量的真实值;△X 为自变量的变化步长。试验因素及水平编码如表1 所示，具体试验设计方案见表2。

表1 太子参多糖提取得率响应面分析因素水平及编码Table 1 Variables and levels of response surface analysis

表2 Box-Behnken 设计方案及太子参多糖提取得率测定值Table 2 Box-Behnken design matrix and extraction yield of Radix Pseudostellariae polysaccharides

采用Design-Expert.v.8.0.5 对试验数据进行回归分析，拟合二次多项式方程，方程可靠性由R2表达，其统计学上的显著性由F 值检验。影响因素线性效应、平方效应及其交互效应的显著性由模型系数的P 值检验。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 超声波功率

由图1 可以看出在其它条件不变的情况下，随着超声波功率的增大，太子参多糖的提取得率逐步提高，当功率达到100 W 时多糖提取得率达到最大值，为传统水提法(即超声波功率为0 时太子参多糖的提取得率)的1.85 倍，表明在仪器额定功率范围内，随超声波功率的增大，太子参多糖提取得率逐步提高。因此，在试验中为提高多糖提取得率，将超声功率设为100 W 的额定功率。

图1 超声波功率对提取得率的影响Fig.1 Effects of ultrasonic power on the extraction yield

2.1.2 提取时间

在保持其它条件不变，改变提取时间时，太子参多糖提取得率的变化情况如图2 所示。有图可见，在提取时间小于60 min 时，随提取时间的延长，提取效率提高显著，随后再延长提取时间，提取得率不再增加，且略有降低。这表明多糖的浸出过程与时间密切相关，时间过短，多糖溶解不充分;而达到一定的提取时间后，原料中多糖已充分浸出，故得率不再增加。但时间过长，又会引起多糖结构的变化进而使得率降低。为缩短工时、减少能耗，太子参多糖的提取时间选择60 min 左右较为合适。

图2 提取时间对提取得率的影响Fig.2 Effects of extraction time on the extraction yield

2.1.3 提取温度

其它条件不变，考察提取温度对多糖提取得率的影响，结果发现，提取温度小于70 ℃时，随着提取温度的升高，太子参多糖提取得率明显增加，而温度大于70 ℃后，多糖提取得率有所下降，如图3 所示。可能是高温条件下部分多糖水解的结果，这也与大多数多糖提取工艺研究结果一致，因此太子参多糖的提取温度选择70 ℃左右为宜。

图3 提取温度对提取得率的影响Fig.3 Effects of extraction time on the extraction yield

2.1.4 水料比对太子参多糖提取得率的影响

其它条件不变，考察水料比对多糖提取得率的影响，结果如图4 所示，随水料比的增大多糖提取得率有增加的趋势，水料比大于25 mL/g 后多糖提取得率下降。分析原因为提取液过少时多糖提取不充分导致提取得率过低，提取液比例过大时，超声波辐射被溶剂大量吸收，不能完全作用于物料，从而影响多糖提取得率。因此太子参多糖提取的水料比为25 mL/g 左右时能获得最高的提取得率。

图4 水料比对提取得率的影响Fig.4 Effects of liquid to solid ratio on the extraction yield

2.2 响应面试验结果

2.2.1 二次回归模型拟合及方差分析

各处理组合的试验结果见表2，应用Design-Expert 7.0 软件对表2 的试验结果进行多元回归拟合获得太子参多糖提取得率(Y)对提取温度(X1)、提取时间(X2)、水料比(X3)3 个自变量的二次多项式回归方程为:Y= 2.35 +0.32x1+0.11x2+0.096x3-0. 068x1x2+ 0. 077x1x3-0. 035x2x3-0. 42x-0. 18x-0.30x对回归方程进行方差分析，结果见表3。

由表3 可知，模型的F 检验结果为P ＜0.0001，表明该回归模型极其显著，且模型失拟项P =0.1034 ＞0.05 不显著，复相关系数R2=0.9846，说明模型拟合程度很好。校正系数R2=0.9475 说明该模型能解释94.75%响应值的变化，仅有总变异的5.25%不能用此模型来解释。因此试验值与预测值非常接近，可以用此模型来分析和预测超声法提取太子参多糖的工艺条件。由表3 中回归模型的方差结果分析可知，提取温度、提取时间、水料比3因素对多糖提取得率均有显著影响，它们对提取得率的影响排序为提取温度(X1)＞提取时间(X2)＞水料比(X3)。

表3 回归模型方差分析表Table 3 Analysis of variance with regression model

2.2.2 响应面交互作用分析与优化

为了进一步研究相关变量之间的交互作用以及确定最优点，我们通过Design-Expert 软件绘制了响应面曲线图，见图5～7。比较响应面三维图可知，在所选范围内存在极值，即响应面最高点。图5 表明，提取温度低、时间短时，多糖提取得率低;但过高的提取温度、过长的提取时间会导致多糖提取得率的下降，这可能是由于时间长，温度高使多糖分解所致，规律与单因素试验基本一致。

图7 提取时间与水料比对太子参多糖提取得率的响应面图Fig.7 Three-dimensional response surface plot of mutual effects of extraction time and liquid/solid ratio on extraction yield

由图5、图6 及图7 响应面立体图可以看出，响应值存在极值，即响应面最高点，进一步通过Design-Expert 软件分析计算可知，当提取温度为73.8℃，提取时间为63.5 min，水料比为25.9 mL/g 时，太子参多糖提取得率达到最大值，为2.43%。考虑到实验的可操作性，把上述条件修正为提取温度为74 ℃，提取时间为65 min，水料比为26 mL/g，并设超声波功率为100 W。

在修正条件下对实验结果进行验证实验，重复3 次，得到太子参多糖平均提取得率为2.48%相对预测值误差为2.1%，二者非常接近，说明该工艺稳定可行，适合太子参多糖提取。

3 结论

本研究首先通过单因素实验选定了参与响应面试验的提取时间、水料比以及提取温度3 个主要因素并设立不同水平，然后应用响应面分析法建立了影响太子参多糖提取得率的二次多项数学模型，经检验该模型具有显著的统计学意义，可用于生产预测。

实验结果表明提取温度、提取时间及水料比各因素及其二次项对多糖提取得率均有显著影响。综合考虑各方面的因素，超声辅助提取太子参多糖的优化条件是:提取温度为74 ℃，提取时间为65 min，水料比为26 mL/g，超声波功率为100 W，此条件下太子参多糖的提取得率可达2.48%。该结果可为太子参多糖提取的工业化生产提供理论参考依据。

1 Liu XH(刘训红)，Chen B(陈彬)，Wang YX(王玉玺).Radix pseudostellariae polysaccharide resist stress and immune enhancement experiment research. Jiangsu J Tradit Chin Med(江苏中医)，2000，21:51-52.

2 Cai J(蔡晶)，Li XD(李孝栋)，Chen XZ(陈旭征)，et al.The immune effects of crude extract of Pseudostellaria polysaccharide in mice. J Fujian Coll TCM(福建中医学院学报)，2005，15:33-35.

3 Ni SD(倪受东)，Xia LZ(夏伦祝)，Xu XX(徐先祥)，et al.Effect of Pseudostellaria polysaccharides in diabetic mice by Alloxan.Anhui Med Pharm J(安徽医药)，2010，14:521-522.

4 Zhang CJ(张昌军)，Yuan FY(原方圆)，Shao HB(邵红兵). Application of extracting polysaccharide compound by ultrasonic method.Chem Ind Times(化工时刊)，2007，21:54-56.

5 Ambat P，Ayyanna C. Optimizing medium constituents and fermentation conditions for citric acid production from palmyra jaggery using response surface methods.World J Microbiol Biotechnol，2001，17:331-335.

6 Chen Y(陈永)，Li Q(李强)，Tan XJ(谭晓晶)，et al.Study on characterization of polysaccharides from Acanthopanax Giraldii Hams. Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2005，45:373-375.

7 Box GP，Behnken DW.Some new three level designs for the study of quantitative variables. Technometrics，1960，2:456-475.

8 Fabio M，Antonio MM. Use of response surface methodology to describe the combined effects of pH，temperature and E/S ratio on the hydrolysis of dogfish(Squalus acantias)muscle.Int J Food Sci Tech，1996，31:419-426.

9 Wang MY(王明艳)，Lu JF(鲁加峰)，Wang XS(王晓顺)，et al. Optimization of extraction of Radix Asparagi polysaccharides using response surface methodology.Food Sci(食品科学)，2010，31:91-95.