应用ADx-ARMS法对大肠癌组织中K- ras 基因突变的检测

高 颖 昌 红 沈 兵 石 峰 张建英

首都医科大学附属北京世纪坛医院病理科，北京 100038

大肠癌是我国最常见的消化道肿瘤恶性肿瘤，近年来随工业化和城市化程度的增高、 居民饮食结构的改变，发病率逐年上升。 2011 年4 月在全国第17 个肿瘤防治周时发布的最新数据表明，北京、上海等大城市大肠癌年发病率接近40/10 万，成为仅次于肺癌的第二位高发恶性肿瘤，是北京市发病率上升最快的恶性肿瘤之一。

近年来随着分子生物学的研究进展，越来越多的研究表明基因突变是肿瘤发生的重要因素。大肠癌的发生与多种信号转导通路系统的功能异常相关，其中Ras/MAPK 是诱发细胞核内反应的重要转导通路。位于表皮生长因子受体（EGFR）下游的K-ras 基因在大肠癌中被认为是启动肿瘤癌变的关键基因之一。 K-ras 基因位于12 号染色体，是Ras 基因家族成员之一，是一种原癌基因，长约35 kb，编码K-ras 蛋白。 研究表明，其与肿瘤的生成、增殖、迁移、扩散以及血管生成均有密切关系。 K-ras 被公认为可用于临床实践的大肠癌有效标志物[1-2]。

既往，针对大肠癌的各种治疗方案选择中主要依据是患者的性别、年龄、体重等因素来确定，千人一药一量的用药原则，导致了患者往往从中获得不同的疗效，既有患者从中受益，又有无效的治疗案例，因此个体化治疗逐步受到重视。 个体化治疗的前提是治疗靶点的检测。 一项涉及9 个国家及地区、千人以上规模的研究显示，没有进行靶标检测而进行靶向治疗，其死亡风险将增加。 因此靶点检测已经成为靶向药物使用前必须检测的项目。2009 年NCCN指南中明确指出大肠癌在使用相关靶向药物之前必须进行K-ras 基因突变的检测。 但目前我国国内K-ras 基因检测方法相差很远，检测的敏感性、特异性差异巨大，应用分子水平的在大肠癌中的突变尚无大规模的数据。本研究以大肠癌患者作为研究对象，应用ADx-ARMS 方法，从分子水平检测K-ras 基因突变的状况。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集首都医科大学附属北京世纪坛医院2012 年4月～8 月的大肠癌标本40 例。 其中男26 例，女14 例；年龄32～86 岁，中位年龄63.5 岁；＜60 岁者17 例，≥60 岁者23例；高分化腺癌5 例，中-低分化腺癌29 例，黏液腺癌6 例；所有病例均经术前或术后病理切片确诊，术前未接受放化疗。

1.2 试剂与方法

1.2.1 检测区域的选择 比照苏木精-伊红染色（HE）在显微镜下标记肿瘤区域， 切片过程中仅选取相关肿瘤区域，避免选择出血及坏死较多的区域。切取5 μm 蜡膜10 张于洁净的环氧树脂（EP）管中，严格做到每一个病例应用一个新的切片，并应用乙醇进行相关器具的消毒处理。

1.2.2 石蜡组织脱蜡处理 加入1 mL 组织脱蜡剂，Vertex混匀后静置1 min，12 000 r/min 离心1 min 后弃上清，重复2 次。 加入无水乙醇1 mL 混匀后静置1 min，12 000 r/min离心1 min 后弃上清，重复2 次。 将EP 管打开，至于37℃的温箱中20 min，使乙醇充分挥发。

1.2.3 样本DNA 提取 待组织中乙醇挥发干净后，应用Qi-Aamp DNA FFPE Tissue Kit 试剂盒（Qiagen 公司生产），对样本进行DNA 提取（方法参照试剂盒说明）。

1.2.4 样本DNA 质量检测 DNA 提取后应用紫外分光光度计测量DNA 质量及浓度。按照测量的DNA 浓度稀释至2～5 mg/L 备用。

1.2.5 实时荧光PCR 检测 应用厦门艾德公司生产的ADx-ARMS-k-ras 检测试剂盒，对K-ras 基因2 号外显子12、13密 码 子 的7 个 突 变 热 点（Gly12Asp、Gly12Ala、Gly12Val、Gly12Ser、Gly12Arg、Gly12Cys 及Gly13Asp）进行检测。

1.3 统计学方法

采用统计软件SAS 8.0 对数据进行分析， 计数资料以率表示，采用χ2检验。 以P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 K-ras 基因突变检测结果

40 例大肠癌样本中共发现K-ras 基因突变14 例，突变率约为35.0%，共检测到5 种突变类型，其中1 例为双突变。 12 密码子突变9 例，13 密码子突变5 例。 见表1。

表1 K-ras 基因突变检测结果（n = 40）

2.1 患者临床、病理特征与K-ras 基因突变状态关系

K-ras 基因突变与年龄及组织学分型无关（P > 0.05），与患者性别（P < 0.05）及腺癌分化程度（P < 0.01）有关。 见表2。

3 讨论

由于大肠癌早期是没有任何症状的，当患者出现了脓血便、肠梗阻进行性贫血而去就诊时，病变多已进展至中晚期，临床分期较晚，从而丧失了许多治疗机会。 每年约有四分之一新诊断的大肠癌患者伴有远处转移，40%～50%的初诊无转移患者在诊断治疗后也会出现远处转移。 晚期转移性大肠癌患者，如果不进行治疗，中位生存期仅为5～6个月。转移性大肠癌五年生存率不足10%[3]。随着人类基因组计划的全面完成及后基因组时代的开启，越来越多的肿瘤癌基因被发现。 对于大肠癌形成及发展的机制研究不断深入，RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK 通路与结直肠癌的发生、发展密切相关的理论逐步被广大学者所接受和证实。 突变的Ras 基因可以持续激活RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK信号传导通路。 而K-ras 基因恰恰是该通路的重要相关基因，其突变可导致细胞的异常增殖及永生化[4]。 K-ras 基因位于12p12.1， 编码位于细胞膜内侧的具有GTP 活性的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白，是EGFR 的下游分子，在膜受体腺苷环化酶信号转导途径中发挥主要作用[5]。 在大肠癌的靶向治疗中，EGFR 抑制剂及抗EGFR 单抗能特异性抑制野生型K-ras 基因的大肠癌细胞生长。 而K-ras 突变型大肠癌患者未能获益， 主要因为K-ras 基因突变后可导致Kras 蛋白不依赖上游信号而永久激活， 从而导致细胞永生化[6-7]。 因此，大肠癌K-ras 基因的突变状态是决定靶向治疗疗效的关键指标[8]。K-ras 基因在大肠癌中发生突变的概率高于其他基因[9]，其在大肠癌中的突变率在欧美国家报道为30%～68%，国内报道为15%～35%[10]。

表2 患者临床、病理特征与K-ras 基因突变状态关系（n = 40）

本研究K-ras 突变率为35.0%，与相关检测数据一致[10]，但本研究样本量较小，可能存在抽样误差，进一步大样本研究将有助于减少误差。 本研究发现，K-ras 突变以12、13密码子的Gly13Asp 及Gly12Val 突变为主， 这与相关文献报道该试剂盒相关位点PCR 扩增效率高，灵敏度高，反应低限可以达到1 copy/μL 的检测结果相一致[11]。 由于突变型K-ras 基因患者不能从针对EGFR 的靶向治疗中获益，因此，中国大肠癌患者靶向治疗前常规检测K-ras 基因具有重要意义。本研究提示，K-ras 基因突变与患者性别及肿瘤的分化程度有相关性，与既往一些研究结果一致[12]。未发现K-ras 基因突变与年龄及肿瘤的病理学类型存在相关性，但也有研究发现K-ras 突变与年龄及性别存在相关性[13]。国内大多数的相关研究采用的检测手段差异较大，从检测蛋白水平的免疫组织化学法到检测分子水平的PCR 法，从传统的直接测序法到焦磷酸测序， 从经典的PCR 法到Real-Time PCR 等， 不同方法对样本的检测灵敏度相差甚远，检测灵敏度1%～50%，因而产生了不同的检测结果，得到了不同的统计数据和结论。

目前国内多采用Real-Time PCR 及测序法对临床样本进行K-ras 突变检测。 测序法是国内大多数第三方检验机构所采用，该方法的优点是准确性较高，可以检测已知及未知突变，是检测的金标准，但由于该方法敏感性低，只有突变的肿瘤细胞大于50%方可检测，同时该方法运行成本大、耗时，特别是对于临床小穿刺活检组织难以检测，因而很难在医院开展。PCR 法因其灵敏度高，速度快，特别是对于样本量较少的珍惜样本有较好的接测结果从而被广大得医院所采用，目前主要得检测方法有普通PCR、荧光定量PCR、高分辨率溶解度曲线法、ARMS 法等等。

本研究使用的是经原国家食品药品监督管理局（SFDA）批准应用于临床体外诊断的ADx-ARMS-K-ras 检测试剂盒。 该试剂盒采用稀有突变检测技术，凭借特异性的环状引物双扩增技术富集扩增突变的DNA，同时结合使用双环探针指示扩增产物， 提高了检测的特异性和灵敏度，克服了传统PCR，直接测序法等检测过程中敏感度不高的缺点，将突变基因DNA 的含量下限降低到了1%。 可以有效地减少因标本中肿瘤细胞少，特别是由于穿刺活检组织中突变肿瘤细胞稀少所导致的假阴性结果的产生。 但该方法也存在这只能检测已知突变的缺点。 由于目前研究的检测方法的不同及检测数据量所限，我国K-ras 基因突变的状态尚不明确。 但随着测序技术的发展，特别是第二代测序（焦磷酸测序）技术的应用，将测序法的灵敏度提高到5%， 建议将ARMS 法与可以测定未知突变的测序法联合使用，进一步进行多中心、大样本研究有助于明确我国K-ras 基因突变与大肠癌的临床、 病理分型及分级之间的相关性， 为21 世纪大肠癌量体裁衣的个体化用药提供可靠的数据。

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