太湖新银鱼线粒体Cytb基因PCR扩增条件的优化

王维维，赵 亮，位晓三

宿州学院化学与生命科学学院，安徽宿州，234000

太湖新银鱼(NeosalanxtaihuensisChen)又名太湖短吻银鱼，中国特有种[1]，隶属银鱼科(Salangidae)新银鱼属(Neosalanx)，是我国重要的经济鱼类[2]。

近年来，太湖新银鱼资源量大量下降，大多数银鱼的原产地已失去渔业价值，因此银鱼科鱼类资源亟待加以保护[3]。太湖新银鱼线粒体Cytb基因的研究对于研究银鱼种群的遗传多样性、遗传结构及种群历史动态等方面具有重要的意义。太湖新银鱼Cytb基因为线粒体基因组中进化较快的片段，具有分子量小、分子结构简单、母系遗传和进化速度快等特点，尤其是线粒体所编码的Cytb基因，被认为是探讨系统进化和分类研究的良好指标，有较强的适用性，已在多种动物类群的系统发育中得到了有效的应用[4-6]。本文采用正交设计实验，对太湖新银鱼线粒体Cytb基因扩增的条件进行优化。采用正交实验设计，用较少的处理组合研究较多的实验因素，大量节约了实验时间。最终对结果进行方差分析，摸索出高效的太湖新银鱼线粒体Cytb基因PCR扩增条件，可以为太湖新银鱼的进一步研究提供一定的技术基础，具有重要的理论和实践意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验样本为淮河流域太湖新银鱼个体，所采集的样本清洗后置于250 mL采样瓶中，加入适量的95%乙醇保存。

1.2 实验试剂

dNTPs、10×PCR buffer(15 pmol/μL Mg2+plus)、Taq DNA聚合酶均为北京全式金生物科技有限公司公司生产，DNA Marker(DL2000)为Takara公司产品，其余的化学试剂均为国产分析纯试剂。

1.3 仪器设备

凝胶成像系统Tanon(天能公司GIS-2008型)、台式高速冷冻离心机(SIGMA 1-15k型)、普通冰箱(格力)、微波炉(格兰仕)、PCR 扩增仪(TL-512)、电泳系统(BIO RAD伯乐公司 PAC300)、纯水仪(MICLIPORE Elix系列)、小型高速离心机(Hema TGL-16H，上海安亭TGL-16C)、高压灭菌锅(HIRAYA HVE-50)、恒温水浴锅(Grant GA100)。

1.4 实验方法

1.4.1 基因组DNA的提取

将100～300 mg太湖新银鱼背部肌肉剪碎后置入500～700 μL裂解缓冲液中，静置30 min，采用氯仿抽提法[7]进行DNA的提取。取4 μL总DNA产物，在120 V电压下电泳40 min。电泳结束后，在紫外投射分析仪下观察结果，并使用凝胶成像系统拍照。DNA样品置于-20℃中保存。

1.4.2 引物设计

用引物设计软件Oligo6自行设计太湖新银鱼线粒体Cytb基因扩增引物。经筛选获得有效扩增引物：前端扩增引物为L14321，即5′-CAGTGACTTG AAAAACCACCG-3′，后端扩增引物为H15634，即5′-CTTAGCTTTGGGAGTTAAGGG-3′。

1.4.3 PCR扩增

采用五因素四水平正交实验[8]设定不同的扩增条件，观察体系中引物浓度、Taq酶浓度、dNTPs浓度、基因组模板浓度、退火温度对扩增结果的影响，选择最佳的PCR扩增条件。扩增条件的正交设计方案如表1，每个方案重复3次，反应扩增程序为：94℃预变性5 min，30个循环每个循环包括94℃变性30 s，不同退火温度退火60 s，72℃延伸2 min，72℃延伸5 min，将PCR产物置于4℃冰箱中保存。

表1 PCR扩增条件正交设计表L16(45)

1.4.4 PCR产物电泳检测

取PCR扩增产物，在1%琼脂糖凝胶上电泳，DL2000 Marker作为标准。在紫外投射分析仪下观察扩增结果，并使用凝胶成像系统拍照备份。检测不同扩增条件下扩增出的条带形状及亮度，采用直观分析法对扩增结果进行评分。

2 结果与分析

2.1 DNA电泳结果

将基因组DNA的提取产物经含0.05% green Ⅰ的1%琼脂糖凝胶电泳在凝胶成像仪上观察,只选取重复性好、电泳清晰的谱带用于PCR。经过分析，第六条带结果最好，如图1，M为DL2000 Marker Plus Ⅱ。

图1 基因组电泳结果

2.2 PCR扩增结果

按照正交设计方案设定的16个处理组合进行PCR扩增，将产物电泳的结果，参照何正文等的正交直观分析[8]方法，将条带最亮、带形规则的扩增结果计为10分，未扩增出结果或出现多条扩增条带的非特异性结果计为1分，其他条带根据条带的强弱和杂带的多少分别打分，结果如下，第1次重复的分值为1～16：5，10，8，2，3，7，6，3，8，4，1，1，6，9，1，1；第2次重复的分值为1～16：4，10，7，3，5，7，5，4，8，8，1，1，7，8，1，1；第3次重复的分值为1～16：5，10，8，3，3，6，5，3，8，4，1，1，7，9，1，2。3次重复结果相差较小，趋于一致，图2为第1次重复的电泳结果图，1～16泳道分别代表相应的处理组合，M表示DL-2000 Marker。16个处理组合的记分结果如上。

图2 PCR产物电泳结果

2.3 方差分析

将评分结果用正交设计助手[9]软件进行方差分析，结果如表2和图3效应曲线图，F比与临界值比较可知：dNTPs浓度对扩增结果影响最大，达极显著水平；Taq酶浓度对扩增结果影响最小，不显著；退火温度、引物浓度对扩增结果也存在影响，达显著水平。在一定浓度范围内，随dNTPs浓度增加，扩增条带亮度增加，但高于一定浓度后，条带亮度降低。退火温度过高，条带特异性强，但亮度较弱，退火温度过低，非特异性反应增强，这可能是因为退火温度低，单引物随机扩增增强，退火温度过高，引物与模板结合差，PCR扩增产物丰度下降。扩增条带亮度受体系中模板浓度影响较小，这可能是因为条带亮度主要受PCR扩增产物富集影响，在低于阀值的范围内，产物亮度与循环数成正比，在适宜的模板浓度范围内，高模板浓度与低模板浓度效果一致。

表2 方差分析表

图3 效应曲线图

3 结 论

本实验研究了Taq酶浓度、退火温度、引物浓度、dNTPs浓度和模板浓度对PCR扩增结果的影响，结果表明：引物浓度、退火温度对实验结果的影响较大，达显著水平；模板浓度、Taq酶浓度对实验结果的影响较小，不显著；dNTPs浓度是影响PCR反应最显著的因素，dNTPs浓度过高可能会产生错误掺入，而浓度过低会降低产量，反复冻融使之活性降低，甚至出现假阴性结果，本试验最佳浓度为2.5 mmol/L。

本文摸索出了适合太湖新银鱼线粒体Cytb基因的最优反应体系，即25 μL的反应体系中，在退火温度为50℃、引物浓度为0.5 umol/L、Taq酶浓度为2.5 U/μL、模板浓度为5 ng/μL、dNTPs浓度为2.5 mmol/L的条件下，太湖新银鱼线粒体Cytb基因扩增效果为最佳，电泳条带清晰、规则。此结果对进一步研究太湖新银鱼种群的遗传多样性、遗传结构及种群历史动态等方面具有重要的意义。

参考文献：

[1]XIE Yu-hao,XIE Han.Classification,Distribution,and Popu-lation Ecology Salangdae Fishes[J].Chinese Journal of Fish-eries,1997,10(2):11-19

[2]ZHANG Yu-ling.A Taxonomic Study on the Chinese Icefishes of the GenusNeo salanx(Pisces:Salangidae) with Description of a New Species form the Lake Taihu[J].Zoological Research,1987,8(3):227-286

[3]ZHAO Liang,XIE Ben-Gui,LIU Zhi-Jin,et al.Molecular Structure and DNA Substitution Rate of the Mitochondrial Control Region and Cytochrome b in Taihu Salangid，Neosalanx taihuensis[J].Chinese Journal of Zoology,2010,45(2):27-38

[4]Tanaka-Ueno T,Matsui M,Sato T,et al,Phylogenetic relationships of brown frogs with 24 chromosomes from Far East Russia and Hokkaido assessed by mitochondrial cytochromeb gene sequences[J].Zoo Sci,1998,15(1):289-294

[5]Briolay J,Galtier N,Brito RM,et al.Molecular phylogeny ofcyprinidae inferred from cytochrome b DNA sequences[J].Mol Phylogenet,1998,9(1):100-108

[7]张民照.总DNA的抽提及其PCR分析条件[J].动物学研究,2001,22(1):20-26

[8]何正文,刘运生,陈立华,等.正交设计直观分析法优化PCR条件[J].湖南医科大学学报，1998,23(4):403-404

[9]曾涛,宋国际.“正交设计助手”软件在银镜反应实验中的应用[J].化学教学,2005,5(5):50-51