副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药敏试验

涂玉蓉 李美娣 武 力

（广州华农大实验兽药有限公司 广州 510642）

副猪嗜血杆菌（Hps）常引起猪的多发性浆膜炎、关节炎以及脑膜炎，由该菌引起的病又称为猪革拉泽氏病［1］。随着世界养猪业的发展，该病已成为全球范围内影响养猪业的一种重要细菌性疾病。

副猪嗜血杆菌在实验室分离培养困难，生长条件苛刻，需要高营养成分和特殊的生长因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，又称辅酶Ⅰ）［2］。本研究在广东地区分离获得4株疑似细菌，通过形态观察、培养特性和生化试验对分离获得的可疑菌株进行初步鉴定，结果表明成功分离到了4株副猪嗜血杆菌；药敏试验结果显示，分离菌株对头孢拉定、环丙沙星、恩诺沙星和菌必治等药物敏感，为广东省各猪场治疗和预防该病提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采自广东省疑似副猪嗜血杆菌病猪场中具有典型病变患猪的内脏组织、胸膜积液和心包液等。

1.1.2 主要试剂 胰蛋白大豆琼脂（Tryptic Soy A-gar，TSA）和胰蛋白大豆肉汤（Tryptic Soy Broth，TSB）为广州环凯生物技术有限公司产品；微量生化管和药敏纸片均为杭州天和生物制品科技有限公司产品；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和小牛血清均为北京鼎国生物技术公司产品；其他化学试剂均为国产分析纯产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养 无菌操作取肝脏、肺脏、脾脏、心脏、胸膜积液和关节液，无菌操作划线接种于TSA平板上，37℃培养24～48 h，观察结果；挑取疑似的单个菌落进一步纯化培养。

1.2.2 染色镜检 将疑似菌株进行涂片、革兰氏染色，然后于显微镜下观察细菌的形态。

1.2.3 培养特性检查 将分离的细菌分别接种于普通琼脂、营养肉汤、含NAD的血琼脂平板及添加了NAD和小牛血清的TSA平板，于37℃条件下培养24～48 h，检查其在不同培养基上的生长表现、菌落特征及在含NAD血琼脂平板上的溶血性等培养特性。1.2.4 生化试验鉴定 将上述纯培养物接种到含有V因子的TSB液体培养基中，200 r/min 37℃振荡培养10 h后，往培养物中添加V因子溶液和血清，使两者终浓度分别为0.01%和5%，轻轻混合均匀，吸取100μL混合液接种到生化管中，封盖，置于37℃温箱中培养 18～72 h 后，观察结果［3］。

1.2.5 V因子依赖性 将上述纯培养物分别接种含V因子和血清的TSB液体培养基和不含V因子的TSB液体培养基中，200 r/min 37℃振荡培养10 h，对比观察有无细菌生长。

1.2.6 卫星现象检查 无菌挑取纯培养菌落，水平划线接种于无V因子的绵羊血琼脂平板上，再无菌挑取金黄色葡萄球菌作垂直划线接种，37℃培养24 h后，观察细菌生长情况。

1.2.7 药敏试验 用无菌棉签蘸取分离菌的TSB液体培养基，均匀涂布接种于TSA平板，等干后，用无菌镊子将各种药敏纸片分别平贴于培养基的表面，于37℃条件下培养24～48 h，观察、测定抑菌环的大小。判定标准：抑菌环直径在15 mm以上的为高度敏感（青霉素高敏为20 mm以上）；10～15 mm为中度敏感；10 mm以下为低度敏感；无抑菌环的为不敏感。

2 结果

2.1 染色镜检结果 涂片并染色后显微镜下可见无芽孢和鞭毛，有荚膜的革兰氏阴性细小杆菌。菌体形态多样，短杆状多见，也有球状、杆状和长丝状，个别呈两极浓染的球杆状（见图1）。

图1 Hps革兰氏染色镜检

2.2 分离培养及培养特性 在添加NAD和小牛血清的TSA平板上，37℃培养24～48 h后，生长良好，形成针尖大小、圆形、半透明及光滑湿润的菌落（见图2）。2.3 V因子需要试验 将上述纯培养物分别接种含V因子和血清的TSB液体培养基和不含V因子的TSB液体培养基中，200 r/min 37℃振荡培养10 h，对比观察有无细菌生长（见图3）。Hps在含V因子的TSB液体培养基中呈云雾状生长，而在无V因子的培养基中则不长。

图2 Hps在TSA固体培养基上的菌落形态

图3 Hps在TSB液体培养基中生长情况

2.4 卫星现象 可见在金黄色葡萄球菌两侧有针尖大小、圆形、边缘整齐的菌落生长，离金黄色葡萄球菌愈近菌落生长越好，愈远菌落越小，呈现出明显的“卫星现象”；而未接种金黄色葡萄球菌的则不见细菌生长，进一步证实Hps依赖V因子生长（见图4）。

图4 卫星现象

2.5 副猪嗜血杆菌药敏试验 试验结果显示，分离菌株对头孢拉定、环丙沙星、恩诺沙星和菌必治等药物敏感，见表1。

表1 药敏试验结果

3 讨论

1）副猪嗜血杆菌是常规饲养猪群上呼吸道的一种常在菌，但是在特定条件下可以侵入机体并引起严重的全身性疾病，尤其在蓝耳病暴发期间尤为严重，给养猪业造成巨大损失［4］。临床上，副猪嗜血杆菌病的临床症状和病理剖检变化易与传染性胸膜肺炎、链球菌病及巴氏杆菌病等混淆。所以，副猪嗜血杆菌的分离培养成为该病诊断的最可靠证据。

2）本研究从广东省各地猪场收集病变典型病料，通过改良培养基营养成分（0.01%V因子鲜血培养基或含0.01%V因子及5%新生牛血清TSA）和培养环境，并根据Hps初次分离生长缓慢、菌落形态小等生长特性，采用二次观察挑菌进行纯培养，有效提高Hps分离率。根据分离菌的形态特征、培养特性、生化反应、卫星现象和V因子依赖性试验结果，均符合副猪嗜血杆菌生物学特征，初步鉴定所分离的4株细菌均为副猪嗜血杆菌。

3）Hps血清型较多，目前报道有15种血清型，各型之间抗原交叉保护力比较低［5］。在不同的地区，其流行的血清型可能不同，一个猪场中经常存在几个菌株或几个血清型，给疫苗免疫带来困难。在药敏试验中，可根据高度敏感的药物对相应发病猪场进行药物治疗，由于副猪嗜血杆菌有15个血清型，不同菌株对同一种抗生素的敏感性存在很大差异，临床用药应在分离菌株的药敏试验结果指导下进行。药敏试验结果显示，分离菌株对头孢拉定、环丙沙星、恩诺沙星和菌必治等药物敏感，为广东省各猪场预防和治疗该病提供试验依据。

［1］ O1vera A，Ca1samig1ia M，Aragon V.Genotypic Diversity of Haemophi1us parasuis Fie1d Strains［J］.App1ied and Environmenta1Microbio1ogy，2006，72：3984-3992.

［2］余小利，苏丹萍，贺东生，等.副猪嗜血杆菌的分型研究进展［J］.广东畜牧兽医科技，2010（4）：13-16.

［3］ O1iveira S，B1acka11 P J，Pijoan C.Characterization of the diversity of Haemophi1us parasuis fie1d iso1ates by use of serotyping and genotyping ［J］.Am J Vet Res，2003，64（4）：435-442.

［4］ 叶飞，贺云霞，徐慧，等.副猪嗜血杆菌病研究进展［J］.动物医学进展，2011，32（2）：101-104.

［5］ De1Rio M L，Gutieerrz C B，Rodriguez Ferri E F.Va1ue of indirect hemagg1utination and coagg1utination tests for serotyping Haemophi1us parasuis ［J］.J C1in Microbio1，2003，41：880-882.