拟南芥ACOS5基因表达模式分析

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(上海大学 上海市能源作物育种及应用重点实验室 上海200444)

0 引 言

拟南芥是一种十字花科植物,由于其基因组较小、生长周期短、容易种植等特点深受众多研究学者喜爱,是当今生物学研究的热门模式，为多数实验室和研究机构的研究对象.花是植物中最后重要的器官之一,而花药在植物花发育中占有重要地位[1].研究表明,拟南芥的花药及小孢子发育在时空上受到精确调控,使花药从分生组织逐步分化、成熟并最终释放花粉[1-2].ACOS5是拟南芥花药中特异表达的一种基因,该基因编码一种脂酰辅酶A合成酶,该酶能够在有辅酶A存在的情况下消耗ATP将肉桂酸、油酸等合成肉桂酰辅酶A和油酰辅酶A[3].其主要参与拟南芥花药绒毡层的形成及发育,若该基因无意突变会直接导致拟南芥雄性不育[2-3].如果在模式植物拟南芥中能够探明ACOS5的基因表达模式,将有助于在水稻、小麦等其他粮食和经济作物中应用.

1 材 料

1.1 植物材料

拟南芥Columbia生态型,于人工光照温室培养,培养条件为温度22℃,16 h光照,8 h黑暗[4].定期进行浇水和营养液浇灌.营养液由上海永通化工有限公司生产.

2 方 法

2.1 基因组抽提

基因组抽提采用康为世纪植物复杂基因组抽提试剂盒进行抽提.

2.2 ACOS5启动子克隆

自www.arabidopsis.org下载ACOS5启动子序列,长度选取转录起始点至上游3Kbp.根据启动子序列设计引物,上下游引物两端分别加入HidIII和Sac1酶切位点.引物合成由上海生工生物工程公司进行合成.

引物序列为:上游(HindIII) CCCAAAGCTTGTAGAGGCTGAGAAATTGTA

下游(SacI) CGGAGCTCGATTTATGTGTTAGGAACAGGG

采用PCR方法对目的序列进行扩增,扩增采用takara公司生产的KOD PCR扩增试剂盒.PCR扩增参数为:

将所扩增的目的片段用taq酶进行加A,加A后进行胶回收操作.胶回收采用takara公司生产的胶回收试剂盒.

2.3 基因测序

将所回收得到的目的片段连入pMD18-T载体进行测序,该产品由TAKARA公司生产.测序公司为上海美吉生物医药科技有限公司.

连接体系(10 μL)如下:

Solution I内含T4 DNA连接酶,为试剂盒内配套试剂.

2.4 GFP基因克隆

实验室自有GFP-T质粒.通过设计引物进行PCR,PCR产物回收加A后连入T载体进行测序.

引物序列为:上游(BamHI):CGCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA

下游(SalI):GCGTCGACTTACTTGTACAGCTCGTCC

PCR扩增参数为

连接体系(10μL)如下:

挑选阳性克隆后送上海美吉生物公司进行测序.

2.5 表达载体构建

以下为实验室自有p1300载体图谱.

图1 p1300载体多克隆位点示意图

首先,将P1300载体以HindIII、SacI进行酶切并回收载体片段.然后,将测序正确的ACOS5启动子以HindIII、SacI自T载体上酶切,并回收连入P1300载体中,并进行阳性克隆筛选和鉴定.将鉴定的载体以BamHI、SalI进行酶切,并回收载体片段备用.将测序正确的GFP基因以BamHI、SalI进行酶切并回收,随后连入上述BamHI、Sal I处理的载体中并进行阳性克隆筛选和鉴定.

GFP连接体系(10 μL)如下:

ACOS5连接体系(10μL)如下:

将两个目的片段分别连入p1300载体后挑选阳性克隆并抽提质粒进行酶切鉴定,剩余质粒备用.

2.6 转化入农杆菌

将构建好的载体热激转化入农杆菌GV3101中.转化方法详见参考文献[5-7].随后进行农杆菌阳性克隆筛选及鉴定.

2.7 转基因

将已转入载体的农杆菌阳性克隆进行划板、挑选单克隆、小型摇培(5 mL)、中型摇培(200 mL)后进行转基因操作.转基因具体步骤详见参考文献[5-8].

2.8 阳性苗筛选

转基因植物转化后3个月收集种子,对种子进行干燥.于50 μg/mL的潮霉素抗性平板上进行阳性苗筛选.并将所筛选到的阳性苗移出至人工光照培养箱进行培养.

2.9 荧光观察

以蔡司LSM710共聚焦显微镜对筛选阳性苗进行荧光鉴定及表型观察,并采用蔡司2.0图形分析软件对拍摄图片进行荧光定量分析,统计不同时期花药内GFP的表达情况.

3 结 果

3.1 启动子克隆

将ACOS5启动子、GFP基因测序结果在NCBI网站与原始序列进行比对,测序结果与原始序列完全匹配,无错配、缺失等.

3.2 载体构建

对构建好的p1300阳性克隆进行质粒抽提和酶切鉴定.分别采用HindIII、SacI对ACOS5启动子,BamHI、Sal I对GFP进行酶切鉴定,分别切出3Kbp条带和750 bp条带及剩余载体带.鉴定结果如图2,3所示:

图2 ACOS5启动子酶切鉴定

图3 GFP酶切鉴定

3.3 转基因植物鉴定

对筛选到的阳性苗基因组进行PCR鉴定,PCR扩增条带包括GFP及ACOS5部分片段,长度约为450bp,抗性平板共筛选到15株阳性苗,经过PCR鉴定结果如下:

鉴定引物为:

F:CTATTTATATTCACTCTAGAG

R:GTACTCCAGCTTGTGCCCCA

图4 转基因植物PCR鉴定

3.4 荧光观察

选取4号、6号转基因植株进行传代,在T3代通过抗性平板筛选分析,得到转基因纯合子.通过共聚焦显微镜对T3代转基因植物进行观察如图四所示.同时对各个时期的荧光强度进行定量.结果显示,转基因植物花药从四期开始微弱表达GFP,并在八期时表达最高,随后逐渐减弱,至十二期时最弱.

图5 共聚焦显微镜分时期观察结果

图6 分时期荧光定量结果

4 讨 论

花粉和花药的发育一直是现代植物学研究的热点,其过程复杂,涉及多个基因的表达及调控.随着分子生物学的不断发展,植物学的研究也不仅仅局限于分类、组织器官的显微观察、解剖观察等方法,而是越来越多地运用现代分子生物学手段对某些基因进行转基因及表达模式分析,这些手段可以直接得到有力的生物学证据,并极大地推动植物花药发育的相关研究.以本研究为例,本报告系统可以直观地对ACOS5的表达模式进行分析,如对不同时期花药中ACOS5的表达观察与分析,并进行量化分析.通过对ACOS5的表达模式进行分析,可以发现该基因在花药发育第八期表达最强烈.据此推测，该基因发挥主要作用的时期为第七到第八期,相关资料显示[1-2],该基因突变会导致雄性不育,那么,可能其主要影响花药发育第七到第八期时的花药结构,使绒毡层完整结构不能建立[2-3],进而导致雄性不育.目前国内外著名学者多数以原位杂交来研究基因的表达模式[3],原位杂交具有一些如实验周期长、不能活体观察、经费开支大等缺点,而以GFP作为报告基因在操作上更方便,时间上更短,经费上更经济,适合在拟南芥花药研究中进行应用.

参考文献:

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[2] 何佳.调控拟南芥雄性不育基因MA的定位及拟南芥MtN3/saliva基因家族分析[D].上海：上海师范大学，2010.

[3] CLARICE A S,SUNG S K,STEFANIE K,et al.A Novel Fatty Acyl-CoA Synthetase Is Required for PollenDevelopment and Sporopollenin Biosynthesis in Arabidopsis[J].The Plant Cell,2009，21:507-525.

[4] 李俊华,张艳春,徐云远.拟南芥室内培养技术[J].植物学通报，2004,21(2):201-204.

[5] JOSEPH S,DAVID W R.分子克隆实验指南(上下册)[M].黄培堂,译.北京:科学出版社,2005:1012-1633.

[6] 张好富,张宪银.一种不依赖于无菌培养的拟南芥活体转基因种子筛选方法[J].浙江大学学报:农业与生命科学版，2009,35(4):372-376.

[7] 樊荣,万小荣,张文涛,等.LE-ACS6启动子在LE-ACS6::GUS转基因拟南芥中的特异性[J].植物生理与分子生物学学报，2004,30(3):351-358.

[8] 张秀春,李文彬,夏亦荠,等.AtNUDT8过量表达的拟南芥转基因植株[J].热带生物学报，2010,1(1):9-10.