急性ITP患儿外周血CD4+CD25+Tr细胞及其与IL-18的相关性研究

雷树勇 陆爱权 陈海云 张绍峰 黄富登

特发性血小板减少性紫癜（ITP）为一种严重疾病，有研究表明ITP患者体内存在T淋巴细胞比例失调，预示着T细胞亚群的紊乱参与ITP的发生发展过程[1-2]。当前ITP发病机制的焦点集中于Th1/Th2细胞之间的失衡，细胞免疫功能紊乱和细胞因子与ITP的发病及临床进展有关，即以Th1漂移为主，IL-18是Thl类细胞因子，作为细胞炎性介质强有力的诱导者，通过刺激型反应，诱导严重的免疫紊乱，从而参与一些免疫疾病的发生发展，其能否促进或抑制Tr细胞的增殖尚未见报道。本研究对42例AITP患儿外周血中CD4+CD25+Tr细胞及IL-18水平进行了测定，旨在进一步探讨IL-18和CD4+CD25+Tr细胞在ITP发病过程中的作用及可能机制，为AITP的临床免疫调节治疗提供一定的理论依据和新的治疗途径。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2009年1月-2010年12月在笔者所在医院门诊、住院部就诊的急性特发性血小板减少性紫癜患儿42例，其中男18例，女24例，年龄0.5~8岁，平均（5.46±2.25）岁，均符合ITP的诊断标准[3]。选取同期在本院体检科正常儿童42例作为对照组，患儿过往没有其他疾病病史，其中男16例，女26例，年龄3~9岁，平均（6.14±3.26）岁；两组年龄、性别等一般资料比较差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的检测 无菌采集ITP患儿及正常健康对照组外周静脉血5 ml，肝素抗凝，以淋巴细胞分离液得淋巴细胞，取分离的T细胞悬液100 μl，分别加入抗CD4-FITC、抗CD25-PE的单抗各20 μl，同型对照分别为IgGI-F1TC、IgGI-PE，混匀，避光孵育25~30 min。1500 r/min离心5 min，弃上清。加入2 ml PBS洗涤液混匀，1000 r/min离心5 min，弃上清。将细胞悬浮于0.5 ml PBS洗涤液中，振荡混匀后上流式细胞仪检测。

1.2.2 细胞因子IL-18检测 所有受检对象清晨空腹抽取静脉血5 ml，离心5 min，3000 r/min，血清分离后放-20 ℃冰箱保存备用。所有标本采集前3个月均未接受过成分血小板输注和任何免疫抑制剂。以酶联免疫吸附法（ELISA）定量检测血清IL-18水平，试剂盒由Biosource公司提供，严格按说明书中的步骤进行操作。

1.3 统计学处理 应用SPSS 16.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以（±s）表示，采用t检验，并对数据进行相关性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 急性ITP组与对照组外周血Tr细胞及血清IL-18水平比较 与正常对照组相比，急性ITP患儿外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的数量及与CD4+细胞的比例均明显降低，而血清IL-18水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），见表1。

表1 急性ITP组与对照组外周Tr细胞的数量及血清IL-18水平比较（±s）

表1 急性ITP组与对照组外周Tr细胞的数量及血清IL-18水平比较（±s）

*P<0.05，△P<0.01，与对照组比较

组别Tr细胞（%）CD4+T细胞（%）Tr细胞/ CD4+T细胞IL-18（pg/ml）急性ITP组（n=42）3.11±0.83*27.36±5.11*0.11±0.02*436.05±95.90△对照组（n=42）5.52±0.8337.18±5.480.15±0.03162.82±57.61

2.2 急性ITP组与对照组外周血Foxp3+Tr细胞表达水平比较 急性ITP患儿外周血Foxp3+Tr细胞与Tr细胞的比值为（0.42±0.12），对照组外周血Foxp3+Tr细胞与Tr细胞的比值为（0.75±0.17），两者差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3 急性ITP患儿外周血Tr细胞表达与血清IL-18水平的相关性分析 将Tr细胞表达与血清IL-18水平进行相关性分析，如图1所示，急性ITP组血清IL-18水平越高，外周血Tr细胞表达水平均越低，二者呈显著负相关（r=-0.821，P<0.01）。

图1 外周血Tr细胞表达与血清IL-18水平的相关趋势图

3 讨论

ITP以患者体内抗血小板抗体增多，血小板破坏过多而出血为特点，发病机制复杂，可能涉及T细胞、B细胞、巨核细胞、细胞因子、转录因子等多因素错综复杂的关系，尤其是T细胞免疫在巨核细胞受抑和血小板破坏中发挥了关键性作用[4]。CD4+CD25+调节性T细胞是近年来发现的存在于正常人外周血和脾脏中一类特定亚群的CD4+T细胞，正常人外周血淋巴细胞中约占5%~10%，具有免疫无能性和免疫抑制性两大特性的调节性T细胞亚群，介导的抑制作用非常复杂，主要通过直接细胞接触途径、分泌抑制性细胞因子途径、间接抑制途径、细胞溶解途径、竞争性抑制途径这五大途径发挥抑制功能，能抑制自身反应性T、B细胞的活化和增殖及自身抗体的产生[5]。由于ITP患者存在自身反应性T细胞的异常活化，活化的CD4+T效应细胞表面也表达CD25分子，很难区分这两群功能不相同的细胞，因此，CD4+CD25+T细胞数量并不能代表真正的调节细胞水平[6]。Foxp3表面分子是脊椎动物叉头样转录因子的总称，特异性表达在CD4+CD25+调节性T细胞上，是CD4+CD25+调节性T细胞的一个特异性标志。Foxp3表达在CD4+CD25+调节性T细胞的发育和功能上起重要作用。Walker等[7]研究表明，CD4+CD25+调节性T细胞细胞的活化可导致CD4+CD25+调节性T细胞表达Foxp3增加，并与抑制活性有关。吕学文等[7]研究发现，ITP者外周血Tr数量减少，Foxp3 mRNA表达也减少，提示Foxp3可能通过翻译水平的改变调节Tr细胞抑制功能。CD4+CD25+调节性T细胞主要通过细胞-细胞直接接触作用和细胞因子发挥调节作用。IL-18是1996年正式命名的细胞因子，主要由单核巨噬细胞产生，是一种强有力的免疫调节因子，其结构与IL-1相似，功能与IL-12相似，但发挥作用却不依赖于两者。IL-18作为细胞炎性介质的诱导者，通过与其受体结合，不仅可诱导IL-2及TNF-α等细胞因子的产生，促进Th1类细胞的增殖、发育和分化，产生Th1型免疫应答，而且可通过增强NK细胞的细胞毒作用，直接诱导NK细胞或T细胞产生INF-γ，从而诱发严重的免疫紊乱。故深入研究IL-18在ITP患者中表达水平的变化，在用于探讨ITP发病机制及指导其治疗中有重要意义。

本研究发现，ITP患儿外周血Tr细胞的数量及CD4+T细胞中Tr细胞的比例均明显低于正常对照组（P<0.05），与芮耀耀等[9]研究结果相符。表明ITP息儿外周血中Tr细胞数量减少，由此可能导致机体自身有效的免疫抑制功能的减弱，使Thl/Th2平衡向Thl偏移，导致Tr细胞数量进一步减少，自身反应性T细胞激活增多、凋亡减少，同时促进自身反应性B细胞增殖，导致B细胞产生抗血小板抗体增多，从而促进了血小板破坏增加。急性ITP患儿外周血Foxp3+Tr细胞与Tr细胞的比值较对照组显著降低（P<0.05），提示缺乏Foxp 3的功能性表达可能导致本应发育为Treg的胸腺T细胞分化为自身反应性T细胞，并逃避阴性选择，攻击自身抗原而致自身免疫病，此可能为导致ITP发病的原因之一[10]。同时笔者的结果也表明，与正常对照组相比，急性ITP患儿患儿外周血血清IL-18水平明显升高（P<0.01），与王谦等[11]研究相符。相关性分析结果表明，IL-18含量与CD4+CD25+调节性T细胞表达之间呈显著负相关，IL-18含量越高，CD4+CD25+调节性T细胞表达越少，表明血清IL18在ITP发病机制上有着重要的作用。IL-18的生物学功能是通过与淋巴细胞表面的IL-18受体（IL-18R）的相互作用实现的。表明IL-18通过上调IL-18R的表达共同参与了ITP患者Thl型反应优势中的病理过程，IL-18与IL-18R结合后，通过IL-1受体相关激酶途径诱导NF-kB的活化，促进INF-γ等Th1细胞相关因子的释放，从而加重Thl/Th2细胞的失衡，IL-18及IL-18R导致Thl细胞的优势应答，可能是ITP发生的机制之一[12]。因此，笔者推测可能由于急性ITP患儿外周血中Tr细胞数量的减少可能刺激外周血淋巴细胞IL-18的生成，加剧了Th1/Th2细胞之间的失衡，导致Tr细胞数量进一步减少，有效的免疫抑制作用降低，自身反应性T细胞激活增多、凋亡减少，促进了血小板的破坏。

总之，急性ITP患儿外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性性T细胞数量减少和II-18水平升高可能在AITP发病中起重要作用，两者共同通过加剧Thl/Th2失衡，机体的免疫调节功能异常从而导致ITP的发生。

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