响应面法优化玉米麸质水中醇溶蛋白提取工艺

刘晓阳 ，张国治 ，黄纪念 ，宋国辉

（1.河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001；2.河南省农科院 农副产品加工研究所，河南 郑州 450002）

0 引言

玉米醇溶蛋白（zein）最早是被Gorham在1821年发现的，最初命名为India protein；由于其可溶于乙醇等醇类溶液，在1924年被Osborne归类为醇溶蛋白.而现在认为玉米醇溶蛋白包括可溶于60%～90%醇类溶液的醇溶谷蛋白，也包括溶于含有还原剂的低浓度醇类溶液的蛋白质，这些蛋白都位于玉米醇溶蛋白体中[1].玉米醇溶蛋白独特的氨基酸组成及其分子形状和结构，决定了它独特的溶解性、成膜性、吸湿性、耐热性和耐脂性，可用于果蔬保鲜，生产可降解塑料、黏合剂、脂肪的模拟品及缓释微胶囊、降压肽和高F值肽等功能性多肽[2-3].可见玉米醇溶蛋白具有广泛的应用前景.

玉米胚乳蛋白主要为醇溶蛋白，占胚乳蛋白总量的60%，还含有26%的谷蛋白以及少量的球蛋白和清蛋白，后两者共占胚乳总蛋白的6%左右[4].在玉米淀粉生产过程中，大部分清蛋白和球蛋白被降解，溶于浸泡水中.玉米醇溶蛋白和谷蛋白的二硫键被还原，谷蛋白被部分溶解，而玉米醇溶蛋白在酸性溶液中即使在加热情况下也不会溶解，几乎完全保留在玉米麸质水沉淀物中[5].

玉米醇溶蛋白提取的原料主要有：湿磨法生产玉米淀粉的副产品玉米蛋白粉和玉米生料发酵生产的乙醇剩余酒糟蛋白饲料和干磨玉米粉.目前商品玉米醇溶蛋白生产大都以玉米蛋白粉为原料[6-7].由于玉米蛋白粉经过高温干燥过程可能造成蛋白变性，且玉米蛋白粉质地坚硬，难以破碎，从中提取玉米醇溶蛋白较为困难，需要用有机溶剂长时间浸提.故考虑从玉米麸质水离心、压滤得到的沉淀中直接提取玉米醇溶蛋白.作者采用响应面试验设计方法，以玉米淀粉生产的麸质水沉淀为原料，玉米醇溶蛋白提取率为指标，优化玉米醇溶蛋白提取工艺得出最佳条件.

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

玉米淀粉生产麸质水：河南中鹤集团.

乙醇、氢氧化钠、盐酸:市售，均为分析纯.

1.2 仪器

DFY-1000摇摆式高速万能粉碎机：温岭市林大机械有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：巩义市予华仪器有限责任公司；DL-5-B低速离心机：上海市安亭科学仪器厂；旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；电热恒温鼓风干燥箱：上海福玛实验设备有限公司；K-05型自动定氮仪：上海晟声自动化分析仪器有限公司.

1.3 方法

1.3.1 玉米醇溶蛋白的提取

玉米麸质水经过离心分离、气浮浓缩和板框压滤得到玉米麸质水沉淀，粉碎后称取5 g于100 mL圆底烧瓶中，加入不同体积分数的乙醇溶液，以试验设定的温度、液料比和时间进行提取.提取结束后，以5 000 r/min离心15 min，收集上清液，沉淀在提取谷蛋白时备用.将提取条件优化后得到的玉米醇溶蛋白提取液减压浓缩至一定浓度（无蛋白沉淀析出，未呈凝胶状态时），加入2倍体积的蒸馏水降低乙醇体积分数，使醇溶蛋白沉淀，以5 000 r/min离心15 min，弃去上清液，将沉淀在烘箱中干燥或真空中冷冻干燥得到成品.

1.3.2 测定方法

原料、提取液和玉米醇溶蛋白成品的蛋白含量用凯氏定氮法测定[8].

式中：c为提取液中玉米醇溶蛋白的质量浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；a为原料蛋白含量（湿基），m为原料质量，g.

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

玉米醇溶蛋白是由分子大小、溶解能力和荷电不同的肽通过二硫键聚合起来的非均相混合物，平均分子质量为44 ku，可溶于60%～90%的醇类溶液[9].单因素试验选择乙醇体积分数（%）、提取温度（℃）、液料比（V/W）、提取时间（min）4个因素考察其对醇溶蛋白提取率的影响.

2.1.1 乙醇体积分数对提取率的影响

称取5 g原料于100 mL圆底烧瓶中，分别加入 45%、55%、65%、75%、85%、95%、100%的乙醇溶液30 mL，50℃下回流提取20 min，以5 000 r/min离心15 min，取上清液用凯氏定氮法测定蛋白含量并计算提取率.乙醇体积分数对提取率的影响如图1所示.

图1 乙醇体积分数对玉米醇溶蛋白提取率的影响

由图1和单因素方差分析结果可知，乙醇体积分数对提取率的影响显著.玉米醇溶蛋白的提取率随着乙醇体积分数的升高呈先升高后降低的趋势，75%的乙醇溶液提取率最高，几乎不溶于45%的乙醇溶液和无水乙醇.说明以提取率为指标时，提取玉米醇溶蛋白的最适乙醇体积分数为75%.

2.1.2 提取温度对提取率的影响

称取5 g原料于100 mL圆底烧瓶中，加入75%乙醇溶液 30 mL，分别在 30、40、50、60、70 ℃温度下回流提取20 min，以5 000 r/min离心15 min，取上清液用凯氏定氮法测定蛋白含量计算提取率.提取温度对提取率的影响如图2所示.

图2 提取温度对玉米醇溶蛋白提取率的影响

由图2和单因素方差分析结果可知，提取温度对提取率的影响显著.其他条件固定，随着温度升高，提取率不断升高.但是温度过高耗能过大，且还可能使部分蛋白变性，Malumaba等[10]发现在温度上升到80℃时，从玉米粉中提取玉米醇溶蛋白的得率显著下降，可能与二硫键的生成与转化有关，另外疏水相互作用、肽链的折叠以及与其他物质生成新的化合键，也可能导致溶解度的降低.综合考虑提取率和能耗响应面优化提取温度应选择60℃.

2.1.3 液料比对提取率的影响

称取5 g原料于100 mL圆底烧瓶中，分别加入 20、30、40、50、60 mL 的 75%乙醇溶液，60 ℃下回流提取20 min，以5 000 r/min离心15 min，取上清液用凯氏定氮法测定蛋白含量计算提取率.液料比对提取率的影响如图3所示.

图3 液料比对玉米醇溶蛋白提取率的影响

由图3和单因素方差分析结果可知，液料比对提取率的影响显著.其他条件固定，随着液料比增大，提取率不断升高.液料比12∶1和10∶1的提取率相当；液料比8∶1与6∶1差异不显著，液料比较低的条件下提取一段时间后，溶液中玉米醇溶蛋白的浓度较高，影响了传质效率，在提取时间一定时，增加溶剂的用量可以提高玉米醇溶蛋白的提取率，但消耗溶剂过多，生产成本提高，因此选取液料比6∶1为优化试验起点较为合适.

2.1.4 提取时间对提取率的影响

称取5 g原料于100 mL圆底烧瓶中，加入75%乙醇溶液30 mL，分别于60℃下回流提取10、20、30、40、50 min，以 5 000 r/min 离心 15 min，取上清液用凯氏定氮法测定蛋白含量计算提取率.提取时间对提取率影响如图4所示.

图4 提取时间对与玉米醇溶蛋白提取率的影响

由图4和单因素方差分析结果可知，随着提取时间的延长，提取率有所增高，但30 min以后提取率基本保持不变，说明玉米麸质水压滤饼粕中的醇溶蛋白，由于未经过高温干燥过程，在75%乙醇中的溶解性较好、溶出速率较快.所以将响应面试验的时间固定为30 min，不再对其进行优化.

2.1.5 提取次数对提取率的影响

称取5 g原料于100 mL圆底烧瓶中，加入75%乙醇溶液30 mL，60℃下回流提取 30 min，以5 000 r/min离心15 min，取上清用液凯氏定氮法测定蛋白含量计算提取率.重复上述两次操作过程，分别以每次离心沉淀的残渣为原料，每次浸提的提取率结果，如图5所示.

由图5可知，提取率随着提取次数的增加呈上升趋势，但第一次提取时提取率已达到（75.49±0.21）%，二次提取时提取率增幅为7.17%，进行3次提取时，提取率仅增加了（0.46±0.059）%.经一次提取就可以达到较高的提取率.虽然，进行多次提取提取率有所升高，但要消耗更多的溶剂和时间，得到的产品价值不能弥补生产成本的增加，所以选择一次提取.

图5 提取次数对玉米醇溶蛋白提取率的影响

2.2 响应面法试验设计及结果分析

2.2.1 响应面法试验设计及方差分析

在单因素试验的基础上，进行响应面试验设计，确定玉米醇溶蛋白提取的最佳工艺.利用SAS软件采用中心组合试验Box-Behenken设计方案[11-12]，以提取率为响应值Y，以乙醇体积分数（X1）、提取温度（X2）、液料比（X3）为因素对工艺参数进行优化.试验因素与水平见表1.

表1 试验因素与水平

利用SAS软件进行试验设计和数据分析，建立回归方程并确定最佳方案.试验设计与结果见表2.

表2 响应面试验设计与结果

利用SAS软件，对表2中数据进行分析得到玉米醇溶蛋白提取率的二次多项回归方程为：

该模型的方差分析如表3所示.

表3 方差分析

由表3可知，试验所选用的二次多项模型具有高度的显著性（p=0.002 2），失拟项在p=0.05水平上不显著（p=0.31＞0.05），其决定系数 R2为 0.972 4，表明此模型拟合较好，可以用此回归方程代替试验真实点进行分析.提取温度的一次项达到极显著水平（p＜0.01），说明其对玉米醇溶蛋白提取率的线性效应显著.回归模型的一次项和二次项都极显著，说明各因素与响应值（提取率）之间不是简单的线性关系；交互项在p=0.05水平上不显著（p=0.75＞0.05），说明交互作用不显著.

2.2.2 响应面试验设计曲面图分析

通过SAS软件输出的响应面试验的曲面（图6—图8），能更直观地反映各因素对于提取率的影响规律.整体而言，在试验选定的条件下，提取温度对于提取率的影响最为显著，随着提取温度的升高提取率不断升高；乙醇体积分数次之，75%的乙醇溶液提取率最高；相对于其他两个因素，液料比对提取率的影响较小.

由图6可知，在试验选定的条件下，乙醇体积分数与提取温度对玉米醇溶蛋白提取率的影响相比，提取温度更为重要，不同体积分数的乙醇溶液作为提取溶剂时，随着提取温度的升高，提取率显著增高，随着提取温度的升高，乙醇体积分数对提取率的影响有所增加.

图6 乙醇体积分数与提取温度对提取率影响的曲面

图7 乙醇体积分数与液料比对提取率影响的曲面

由图7可知，在试验选定的条件下，液料比对玉米醇溶蛋白提取率的影响不大，中间水平体积分数的乙醇溶液，更适于作为玉米醇溶蛋白的提取溶剂，较高水平比低水平体积分数的乙醇溶液提取率更高.

图8 提取温度与液料比对提取率影响的曲面图和等高线图

由图8可知，在试验选定的条件下，提取温度与液料比对玉米醇溶蛋白提取率的影响相比，提取温度更为重要，随着提取温度的升高，提取率显著增高，在高温区域液料比对提取率的影响更小.

2.2.3 验证试验与结果分析

通过SAS软件分析，由模型得到的二次多项回归方程预测玉米醇溶蛋白的最佳提取工艺参数为：乙醇体积分数74.49%，提取温度67.95℃，液料比7.45∶1；玉米醇溶蛋白提取率的预测值为（82.29±0.67）%.考虑到实际的操作和工业实际情况，选取乙醇体积分数74.5%，提取温度68℃，液料比7.5∶1（V/W）进行验证试验，得到玉米醇溶蛋白的提取率为（82.17±0.24）%，与预测值无明显差异.因此，采用响应面法优化玉米醇溶蛋白提取的最佳条件数据可靠，具有应用价值.回收得到的玉米醇溶蛋白固体的蛋白含量为87.66%，回收效率为（90.86±1.2）%.

3 结论

试验通过响应面试验设计优化得到玉米醇溶蛋白提取的最佳工艺为：乙醇体积分数74.5%，提取温度 68℃，液料比 7.5∶1（V/W），提取时间 30 min时醇溶蛋白的提取率最高可达82.17%，纯度为87.66%.与从玉米蛋白粉中提取玉米醇溶蛋白需要1.5～2 h相比，直接从玉米麸质水沉淀中提取在提取时间为30 min时，提取率已经达到最高[13-14].从玉米麸质水气浮沉淀，压滤后得到的饼粕中直接提取玉米醇溶蛋白，既省去了热风干燥的过程，降低能耗，又可降低蛋白的变性程度，提高所制备醇溶蛋白的提取率，减少提取时间，提高生产效率，节约生产成本.

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