黄连素抑制人卵巢癌SKOV3细胞增殖并诱导凋亡

张春洁，金 平，李 娜

(1.兰州大学第一临床医学院妇产科学，甘肃兰州730000;2.深圳市妇幼保健院妇产科，广东深圳518028)

黄连素(berberine)对多种肿瘤有抑制增殖和诱导凋亡的作用［1－2］，但在卵巢癌中的作用尚未见报道。本研究以人卵巢癌SKOV3细胞为研究对象，观察黄连素对SKOV3细胞增殖抑制作用及凋亡诱导效应。

1 材料与方法

1.1 材料:黄连素(永嘉天然植物开发有限公司)。SKOV3细胞(兰州大学医学实验中心)含10%胎牛血清的RPMI-1640于37℃、5%CO2饱和湿度下培养。实时荧光定量RTPCR试剂(大连宝生物)。

1.2 方法

1.2.1 MTT检测细胞增殖抑制率:将7×104个细胞接种于96 孔板，贴壁后，0、12.5、25、50、100 和200 μmol/L黄连素处理24、48、72 h，弃上清，每孔加入 MTT(5 g/L)10 μL，继续孵育4 h，加入酸化10%十二烷基硫酸钠100μL，次日在570 nm波长处检测吸光度值。每组4个复孔。抑制率(%)=［1－(加药组A值/对照组A值)］×100%，实验重复3次。

1.2.2 PI单染法检测细胞周期分布:收集细胞，70%冰乙醇固定过夜，PBS洗两次，PI避光染色30 min，流式细胞仪检测。

1.2.3 Annexin V和PI双染法检测细胞凋亡:收集细胞，加入Annexin V和PI，室温避光染色10 min，流式细胞仪检测。

1.2.4 透射电镜观察细胞凋亡:收集细胞，2.5%戊二醛固定，1%锇酸后固定，丙酮脱水，树脂包埋，超薄切片，透射电镜下观察细胞凋亡形态。

1.2.5 实时荧光定量RT-PCR法检测基因表达:收集细胞，用总RNA提取试剂盒和实时荧光定量RT-PCR反应试剂盒，按照说明书先提取总RNA，再进行RT-PCR反应。引物设计和合成:参考文献［3］，内参照基因选β-actin，大连宝生物合成。

2 结果

2.1 黄连素抑制细胞增殖活性:黄连素呈药物浓度和时间依赖性抑制细胞增殖(p＜0.05)(表1)。

表1 黄连素对SKOV3细胞生长的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of berberine on the growth of SKOV3 cells，%，n=3)

表1 黄连素对SKOV3细胞生长的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of berberine on the growth of SKOV3 cells，%，n=3)

*p＜0.05 compared with berberine 12.5μmol/L;#p＜0.05 compared with 24 hours．

berberine(μmol/L)inhibition rate 24 hours 48 hours 72 hours 0－－－12.5 7.87±1.03 15.46±0.98# 20.88±1.35#25 10.03±0.98* 20.03±1.99*# 38.63±1.82*#50 25.66±2.38* 39.96±2.94*# 51.09±2.00*#100 37.9±1.02* 50.52±1.21*# 60.13±1.94*#200 45.59±1.56* 61.33±1.39*# 75.54±1.39*#

2.2 黄连素影响SKOV3细胞周期分布:不同浓度黄连素作用后，与对照组相比，G0/G1期细胞增多，S期细胞减少，随着黄连素浓度增加，改变愈明显(表2)。

表2 黄连素对SKOV3细胞周期的影响Table 2 Effect of berberine on cycle cycle distribution of SKOV3 cells，%，n=3)

表2 黄连素对SKOV3细胞周期的影响Table 2 Effect of berberine on cycle cycle distribution of SKOV3 cells，%，n=3)

＊P ＜0.05 compared with berberine 0 μmol/L;＊＊P ＜0.01 compared with berberine 0 μmol/L．

berberine(μmol/L)cell cycle G0/G1 S G2/M 0 62.11±1.31 33.63±2.31 4.26±1.04 25 69.60±0.99* 28.62±1.08 1.78±0.21*50 77.86±0.22＊＊ 20.89±0.06* 1.25±0.19*100 81.49±1.52＊＊ 17.58±1.46＊＊ 0.93±0.17*200 85.54±2.21＊＊ 13.94±2.30＊＊ 0.52±0.13*

图1 黄连素作用后SKOV3细胞超微结构改变Fig 1 The ultrastructure changes of SKOV3 cells treated with berberine

2.3 黄连素促进细胞凋亡:25、50、100和200μmol/L黄连素作用48 h，细胞凋亡率分别为(18.89±1.79)%、(36.11±3.01)%、(52.9±0.07)%和(62.4±0.1)%，显著高于对照组(1.15±0.076)%(p＜0.05)。

2.4 黄连素导致细胞超微结构改变:正常SKOV3细胞膜完整，核大，无明显染色质边集，胞质内细胞器丰富。经黄连素作用后，胞膜破损直至消失，核染色质高度浓缩、边集于核膜下，呈半月形，或出现核固缩和核碎裂，胞质出现空泡变性(图1)。

2.5 黄连素影响细胞BCL-2、BAX和SURVIVN mRNA的表达:100和200μmol/L黄连素作用48 h，基因表达量为BCL-2 0.88±0.19和0.60±0.18，SURVIVIN为0.73±0.05和0.31±0.06，二者显著低于对照组的1;而BAX为33.44±2.75和53.19±2.66，显著高于对照组的1(p＜0.05)。

3 讨论

实验结果显示，黄连素对人卵巢癌SKOV3细胞增殖有明显抑制作用，呈现明显的时间和浓度依赖性。黄连素作用后，细胞的凋亡率明显高于对照组，浓度越高，凋亡率越高，并出现典型凋亡细胞超微结构的特征。黄连素将卵巢癌细胞阻滞在G0/G1期，从而调节G0/S转换，使进入S期的细胞减少，周期进程受阻的细胞，发生凋亡。

BCL-2基因家族在细胞凋亡中起着重要作用。BCL-2主要通过与BAX形成二聚体发挥作用，二者的比例决定细胞发生凋亡与否。SURVIVIN是迄今发现最强的凋亡抑制因子，其表达程度与肿瘤的发展及预后密切相关。本实验表明，黄连素能够下调BCL-2、SURVIVIN表达，上调BAX表达，说明黄连素诱导的细胞凋亡可能与调节BCL-2基因家族和SURVIVIN的表达有关。

综上所述，黄连素对于人卵巢癌SKOV3细胞的增殖抑制作用和诱导凋亡效应可能是通过调节细胞周期和影响BCL-2、BAX、SURVIVIN基因的表达实现的。黄连素有望成为治疗卵巢癌的有效化疗药物，具有较大的开发价值。

［1］ Lee SJ，Noh HJ，Sung EG，et al．Berberine sensitizes TRAIL-induced apoptosis through proteasome-mediated downregulation of c-FLIPand Mcl-1 proteins［J］．Int J Oncol，2011，38:485 －492．

［2］Jie S，Li H，Tian Y，et al．Berberine inhibits angiogenic potential of Hep G2 cell line through VEGF down-regulation in vitro［J］．J Gastroenterol Hepatol，2011，26:179 －185．

［3］ Ahamed M，Akhtar MJ，Siddiqui MA，et al．Oxidative stress mediated apoptosis induced by nickel ferrite nanoparticles in cultured A549 cells［J］．Toxicology，2011，283:101－108．