枯否细胞在高脂诱导的肝脏胰岛素抵抗中的作用*

李树颖 张 怡 郭玉玺 李 晶 潘从清

研究显示，胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）是一种慢性炎症状态，巨噬细胞在肥胖脂肪组织的浸润、激活参与脂肪组织IR发生的观点已被接受[1]，但枯否细胞（Kupffer cells，KCs）是否参与高脂诱导的肝脏IR还存在争议。本研究拟通过对不同阶段高脂喂养小鼠肝脏炎性因子表达的检测，观察其与肝脏IR发生的关系，探讨KCs在高脂诱导的肝脏IR中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级C57BL/6J小鼠84只，6周龄，体质量（15.62±3.14）g，雄性，购自中国医学科学院实验动物研究所。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 按照随机数字表将小鼠随机分为普食组和高脂组，每组42只，每组内再随机分为7小组，每组6只。分别给予普食（脂肪占饲料热量组成的6.2%）和高脂（脂肪占饲料热量组成的59.3%）喂养。

1.2.2 血清胰岛素检测 6组普食和6组高脂小鼠分别在喂养第1、2、4、8、12和16周处死小鼠前空腹尾静脉取血，于4℃3 000 r/min离心10 min，取上清-80℃保存，按照小鼠胰岛素酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（shibayagi株式会社，日本）说明书操作检测小鼠血清胰岛素含量。

1.2.3 葡萄糖耐量试验 1组普食和1组高脂小鼠分别在普食和高脂喂养后1、2、4、8、12和16周行葡萄糖耐量检测，小鼠实验前一晚去除饲料，更换鼠笼、垫料，可自由饮用水，饥饿过夜16 h，次日晨轻剪鼠尾，血糖仪检测血糖后称质量，按1 g/kg腹腔注射葡萄糖溶液，分别在注射后15、30、60、120 min取血检测血糖。计算葡萄糖曲线下面积（AUG）＝1/4×空腹值＋1/2×15 min值＋3/4×30 min值＋60 min值＋1/2×120 min值。

1.2.4 Western blot检测肝组织蛋白表达 分别在喂养第1、2、4、8、12和16周处死小鼠取肝脏，-80℃冻存。取肝组织0.1 g匀浆，RIPA细胞裂解液提取肝组织总蛋白，BSA法测定蛋白浓度。取60 μg蛋白样品经10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，转膜，封闭，免疫印迹法分别检测抗蛋白激酶B丝氨酸473（Akt-ser473）抗体、抗胰岛素受体底物1丝氨酸307（IRS1-ser307）抗体、抗核糖体蛋白S6激酶1苏氨酸389（S6K1-thr389）抗体、抗β肌动蛋白（βactin）抗体（均为1∶1 000稀释，Cell signaling公司，美国）或磷酸化c-Jun氨基末端激酶抗体（p-JNK,1∶1 000稀释，Santa公司，美国），4℃孵育过夜，羊抗兔IgG-HRP二抗（1∶5 000，Santa cruz公司，美国）室温孵育2 h，化学发光法显影，X线胶片压片曝光，用Image J软件处理，各蛋白的磷酸化相对表达量=磷酸化的蛋白水平灰度值/相对应β-actin灰度值。

1.2.5 单核细胞趋化蛋白（MCP）-1、肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β、IL-10 mRNA表达水平 Trizol提取肝组织总RNA。取2 μg总RNA，采用逆转录试剂盒（大连宝生物工程有限公司）合成cDNA，利用SYBR Green（罗氏公司，德国）在ABI7500实时定量-PCR仪进行扩增。引物序列β-actin 上游 5＇-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3＇，下游 5＇-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3＇；MCP-1上游 5＇-GCAGT⁃TAACGCCCCACTCA-3＇，下游 5＇-CCCAGCCTACTCATT⁃GGGATCA-3＇；TNF-α上游5＇-CGTCGTAGCAAACCACCAA-3＇，下游5＇-GAGAACCTGGGAGTAGACAAGG-3＇；IL-1β上游 5＇-ATCACTCATTGTGGCTGTGG-3＇，下游 5＇-GTCGTTGCTTG⁃GTTCTCCT-3＇；IL-10 上游 5＇-GCGTCGTGATTAGCGAT⁃GATG-3＇，下游 5＇-CTCGAGCAAGTCTTTCAGTCC-3＇。扩增反应采用25 μL体系：SYBR Green PCR混合物12.5 μL，上游引物 1 μL（10 μmol/L），下游引物1 μL（10 μmol/L），cDNA 5 μL，加双蒸水至25 μL。反应条件为：模板cDNA 94℃变性4 min后进行循环，变性94℃15 s，退火60℃10 s，延伸72℃10 s，共40个循环。记录目的基因Ct值和内参照基因Ct值，根据实时定量-PCR相对定量的2-△Ct法计算目的基因表达的相对值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 12.0软件进行统计学分析，实验数据以x±s表示，两组比较采用t检验，Plt;0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同时间小鼠血清胰岛素水平比较 高脂喂养小鼠后1、2周，2组小鼠血清胰岛素差异无统计学意义，在第4、8、12和16周时，高脂组小鼠血清胰岛素水平均高于普食组（P＜0.05或P＜0.01），见表1。

Table 1 Comparison of serum insulin levels in different time points between two groups表1 不同时间2组小鼠血清胰岛素水平比较（n=6，μg/L，x±s）

2.2 不同时间2组小鼠葡萄糖耐量曲线下面积比较 和普食组相比，高脂组1、2、4、8、12、16周的葡萄糖耐量曲线下面积均增大（P＜0.05或P＜0.01），见表2。

Table 2 Comparison of areas under the curve of glucose tolerance test between two groups表2 2组小鼠葡萄糖耐量试验曲线下面积比较（n=6，mmol·L-1·min-1，x±s）

2.3 不同时间2组小鼠肝脏IRS-1、S6K1、Akt、JNK磷酸化表达比较 与普食组相比，高脂组小鼠肝脏IRS1-ser307、S6K1-thr389（第4～16周）、p-JNK表达增强（2～16周），Akt-ser473（8～16周）表达减弱，见图1。1～2周时，2组小鼠IRS1-ser307、S6K1-thr389相对表达量差异无统计学意义（P＞0.05），第4～16周高脂组高于普食组（均P＜0.01），见表3、4。1～4周时，2组小鼠Akt-ser473相对表达量差异无统计学意义（均P＞0.05），第8～16周时高脂组低于普食组（均P＜0.01），见表5。第2～16周时，高脂组小鼠p-JNK相对表达量均高于普食组（均P＜0.01），见表6。

Figure1 Comparison of phosphorylation state of hepatic IRS-1,S6K1,Akt and JNK expressions in different feeding time between two groups of mice图1 不同时间2组小鼠肝脏IRS-1、S6K1、Akt、JNK磷酸化表达比较

Table 3 Comparison of relative expression levels of hepatic IRS1-ser307 between two groups of mice表3 2组小鼠肝脏IRS1-ser307相对表达量比较（n=6，x±s）

Table 4 Comparison of relative expression levels of hepatic S6K1-thr389 between two groups of mice表4 2组小鼠肝脏S6K1-thr389相对表达量比较（n=6，x±s）

Table 5 Comparison of relative expression levels of hepatic Akt-ser473 between two groups of mice表5 2组小鼠肝脏Akt-ser473相对表达量比较（n=6，x±s）

Table 6 Comparison of relative expression levels of hepatic p-JNK between two groups of mice表6 2组小鼠肝脏p-JNK相对表达量比较（n=6，x±s）

2.4 不同时间2组小鼠炎性因子表达变化 1周时，2组小鼠MCP-1、TNF-α、IL-1β mRNA表达比较差异无统计学意义（P＞0.05），第2～16周时，高脂组上述指标表达量均高于普食组（均P＜0.01），见表7～9。而第1～2周时2组抗炎因子IL-10 mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05），第4～16周时，高脂组低于普食组（均P＜0.01），见表10。

Table 7 Comparison of hepatic MCP-1 mRNA expression between two groups of mice表7 2组小鼠肝脏MCP-1 mRNA表达的比较（n=6，x±s）

3 讨论

3.1 巨噬细胞在IR中发挥作用 巨噬细胞可分为“传统”激活巨噬细胞（M1型）和“选择”激活巨噬细胞（M2型）2种，M1型主要分泌TNF-α、IL-1β等炎性因子；M2型主要分泌IL-10等抗炎因子，炎性因子可激活c-Jun氨基末端激酶（JNK）通路引起胰岛素受体底物（IRS）1丝氨酸磷酸化增加，导致胰岛素信号传导障碍[2]；IL-10则通过抑制转录信号转导子与激活子3（STAT3）在胰岛素信号中发挥保护作用[3]。研究发现，高脂喂养小鼠1周，脂肪组织巨噬细胞（adipose tissue macrophage，ATM）即开始在脂肪组织浸润，且随喂养时间及肥胖增加而浸润加重[4]，在此过程中ATM表型由抗炎的M2型向致炎的M1型转变，且与IR的程度一致[5]。KCs是肝脏巨噬细胞，其是否同ATM一样在肝脏IR中发挥作用目前还存在争议。

Table 8 Comparison of hepatic TNF-α mRNA expression between two groups of mice表8 2组小鼠肝脏TNF-α mRNA表达的比较（n=6，x±s）

Table 9 Comparison of hepatic IL-1β mRNA expression between two groups of mice表9 2组小鼠肝脏IL-1β mRNA表达的比较（n=6，x±s）

Table 10 Comparison of hepatic IL-10 mRNA expression between two groups of mice表10 2组小鼠肝脏IL-10 mRNA表达的比较（n=6，x±s）

3.2 KCs参与肝脏IR的发生 本研究发现，高脂喂养小鼠第2～16周炎性因子TNF-α、IL-1β mRNA在肝脏表达高于普食组，抗炎因子IL-10 mRNA第4～16周表达低于普食组。Western blot结果也显示高脂饮食喂养第2周，高脂组小鼠肝脏炎性信号p-JNK相对表达量高于普食喂养小鼠，显示高脂饮食引起小鼠肝脏处于炎性状态。第4周开始，高脂组肝脏IRS1-307、S6K1-thr389相对表达量高于普食组；第8周高脂组Akt-ser473相对表达量开始低于普食组，提示出现肝脏IR。MCP-1可趋化循环中的单核细胞进入肝脏转变为巨噬细胞[6]。本研究发现在小鼠喂养第2周开始，高脂组MCP-1 mRNA表达开始高于普食组，推测高脂饮食可能通过征募单核细胞进入肝脏引起KCs在肝脏浸润增加，并促进肝脏M1型KCs释放炎性因子、抑制M2型KCs释放抗炎因子，通过影响肝脏胰岛素信号从而引起了肝脏IR的发生。另外，本研究发现高脂还可引起血清胰岛素水平增加，造成小鼠对葡萄糖代谢能力的下降，推测高脂造成的肝脏IR可引起肝糖原合成能力下降，从而在糖耐量异常中发挥一定作用。

3.3 饱和脂肪酸促进肝脏IR 近年来有研究认为KCs介导了高脂诱导的肝脏IR[7]，但也有研究认为其保护肝脏免于高脂诱导的IR[8]。高脂饮食中的饱和脂肪酸成分可激活M1巨噬细胞介导IR[9]，而单不饱和脂肪酸则激活M2巨噬细胞发挥保护作用[10]，不同的研究结果可能与高脂中的饮食成分有关。本研究使用的高脂饮食以猪油为主，为饱和脂肪酸，故通过激活M1型KCs细胞、抑制M2型KCs介导肝脏IR的发生。

综上所述，在营养过剩条件下，高脂饮食可能通过调节M1型KCs分泌炎性因子TNF-α、IL-1β，抑制M2型KCs分泌抗炎因子IL-10在肝脏IR中发挥作用。但高脂是通过何种途径在肝脏诱导该改变的发生有待进一步研究。

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