硫化氢在SB203580影响肝星状细胞增殖、凋亡中的作用*

徐 霞 李 睿 任 嫱 刘 芳 宋丽秀 郑 勇 陈卫刚△

硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）被称为继NO、CO之后发现的第三种气体信号分子，它具有多种生理功能，尤其在肝纤维化中作用明显[1]。研究显示，内源性或外源性H2S能以多种方式调节细胞的增殖与凋亡，其作用与H2S的剂量和信号途径有关[2]。最近研究表明，H2S对肝纤维化及门脉高压的发生发展起重要的保护作用[3]。本研究通过Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术（FCM）检测肝星状细胞（hepat⁃ic stellate cell，HSC）凋亡情况，并用逆转录聚合酶链反应（PCR）法检测HSC中Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达，初步探讨H2S在P38丝裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）阻断剂SB203580影响HSC增殖、凋亡中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠HSC-T6细胞株购自中南大学湘雅中心实验室；NaHS（美国Sigma公司）；SB203580（德国Merck公司）；DMEM（高糖）培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶-EDTA（美国HyClone公司），二甲基亚砜（DMSO，美国Amersco公司），逆转录试剂盒（美国Fermentas公司），琼脂糖（Spanish公司），TRIzol（美国Invitrogen公司），四甲基偶氮唑盐（MTT，美国Sigma公司），Annexin V-FITC试剂盒（美国Biovision公司），流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HSC-T6选用100 mL/L FBS DMEM（高糖）培养基，按1.5×105个/mL接种，37 ℃、5%CO2中培养，8 h常规贴壁，1～2 d换液，4～7 d后细胞铺满瓶底70%～90%传代，传代周期稳定即可用于实验。

1.2.2 实验分组 对照组：10%FBS的DMEM培养基；DMSO组：对照组基础上加DMSO，使DMSO终浓度为0.1%；NaHS组：对照组基础上加NaHS（H2S供体）至最适浓度；SB组：DMSO组基础上加SB203580至最适浓度；SB+NaHS组：SB组基础上加NaHS至最适浓度。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖 在无菌96孔细胞培养板中接种传代的HSC，每组6复孔，调整细胞浓度为6×104个/mL，每孔加入200 μL细胞悬液，当细胞生长至80%以上融合度时，用无血清培养基同步化处理12 h。NaHS组分别按照25、50、75、100、200 μmol/L浓度梯度给药，SB组分别按照10、25、50、75、100 μmol/L浓度梯度给药，确定最适浓度。在CO2培养箱中继续孵育48 h后，除边缘孔外每孔均加入5 g·L-1的MTT 20 μL。反应4 h后用1 mL注射器吸去培养基，并加150 μL DMSO，反应30 min后用酶标仪测定其吸光度（A）值，测定波长570 nm，参考波长630 nm，计算A值=A570-A630，以消除非特异性光吸收效应。计算细胞增殖抑制率（IR），IR=（1-实验组A/对照组A）×100%。

1.2.4 FCM检测细胞凋亡 将传代的HSC接种于6孔培养板中，在细胞生长至80%以上融合度后，吸去原培养基，换为无血清培养基同步化处理24 h，按照实验分组分别加入相应浓度的NaHS和SB203580，加样后的各组细胞继续在CO2培养箱孵育48 h后开始取样，取样方法：每孔用PBS洗2遍，各加300 μL胰酶消化，持续吹打使其分散，PBS离心（1 000 r/min离心5 min）洗涤2次，加入binding buffer和Annexin V-FITC/PI双染色剂，4℃避光30 min后上机检测细胞凋亡率。

1.2.5 逆转录PCR法测Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达 应用TRIzol试剂按说明书提取HSC总RNA，用紫外分光光度仪测定总RNA的纯度及浓度。A260/A280≥1.8说明RNA纯度较高。琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的完整性，-80℃保存待用。（1）cDNA第一链合成：逆转录使用RevertAidTMH minus First Strand cDNA Synthesis Kit，按照说明书方法进行。（2）逆转录PCR反应。PCR扩增反应体系为25 μL，其中cDNA 2 μL，上下游引物各0.5 μL，PCR Master Mix(2×)12.5 μL，DEPC水定容至25 μL。设计引物，Ⅰ型胶原引物序列：正义5′-GGTCCCAAAGGTGCTGATGG-3′，反 义 5′-GACCAGCCT⁃CACCACGGTCT-3′；Ⅲ型胶原引物序列：正义5′-CGAGGT⁃GACAGAGGTGAAAGA-3′，反义 5′-AACCCAGTATTCTCC⁃GCTCTT-3′；GAPDH引物序列：正义5′-CAAGGTCATCCAT⁃GACAACTTTG-3′，反义5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。PCR扩增条件为：Ⅰ型胶原95 ℃ 5min，95℃ 30 s，58 ℃30 s，72℃ 30 s，共37个循环，72℃延伸 10 min；Ⅲ型胶原95℃ 5 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共36个循环，72℃延伸10 min。（3）PCR产物用20 g/L琼脂糖凝胶进行电泳分析，采用Quantity one 4.6.2凝胶成像分析系统计算各个条带的A值，以各样本蛋白与GAPDH的比值表示mRNA的相对表达水平。

1.3 统计学方法 使用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料以±ss表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANO⁃VA），组间多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NaHS对SB203580影响HSC增殖的作用 50 μmol/L NaHS组的A值高于对照组（P＜0.05），其余NaHS组与对照组差异无统计学意义；不同药物浓度SB组的A值均低于对照组（P＜0.05），但因低浓度SB203580无明显抑制HSC增殖，而高浓度SB抑制率较大且影响细胞形态，故75 μmol/L SB为最适浓度，见表1。倒置显微镜下观察NaHS组细胞较对照组明显增多，细胞形态未见改变，而SB组细胞内可见较多空泡状及凋亡细胞，细胞数量无明显增多，见图1。

Table 1 Comparison of cell proliferation of HSC-T6 between groups表1 各组HSC-T6细胞增殖情况的比较

2.2 SB203580和NaHS对HSC-T6凋亡的影响 从FITC和PI荧光双参数点图观察到，对照组HSC-T6主要分布在左下象限，因操作等原因引起的机械性死亡细胞数量非常少（＜2%），见图2。SB组、SB+NaHS组细胞凋亡率高于对照组，且SB+NaHS组高于SB组（均P＜0.05）；DMSO组、NaHS组与对照组差异无统计学意义，见表2。

Table 2 Comparison of apoptotic rates in HSC T6 between five groups表2 各组HSC-T6凋亡率的比较

2.3 SB203580和NaHS对HSC-T6Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA水平的影响 HSC-T6中Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA在各组中均表达，其中NaHS组表达高于对照组（P＜0.05），且表达量最多，条带最亮、最宽，SB组与SB+NaHS组表达低于对照组和NaHS组（P＜0.05），表达量较少，条带较暗，见表3、图3。

Table 3 The expressions of COL-Ⅰand COL-ⅢmRNA in HSC T6 between five groups表3 各组HSC-T6Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达

3 讨论

HSC活化是肝纤维化的中心环节，活化后的HSC是肝内胶原及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的主要来源。肝脏受损时HSC被激活，分泌大量ECM，并表达Ⅰ、Ⅲ型胶原等促纤维化因子。H2S作为一种新型内源性气体信号分子，存在于人体多个系统，具有广泛的生物学效应。课题组前期研究结果表明H2S能够促进肝硬化大鼠肝组织内某种细胞的增殖，减少肝细胞损伤[4]；外源性H2S可使抗凋亡分子survivin蛋白及基因表达上调，从而减少肝细胞凋亡[5]；肝硬化大鼠给予H2S代谢酶抑制剂后门静脉压力升高[2]，提示H2S在肝硬化发生发展过程中及调节门静脉压力方面起重要保护作用。

Figure 3 The expressions of COL-Ⅰand COL-ⅢmRNA in HSC T6 detected by RT-PCR assay图3 逆转录PCR检测HSC-T6Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达

P38MAPK信号通路与细胞增殖、凋亡等多种生物学行为密切相关。Keuling等[6]用SB203580特异性阻断P38MAPK通路能够增强ABT-737诱导的黑色素瘤细胞凋亡。有研究者发现P38MAPK不仅参与调节α1（Ⅰ）型胶原mRNA表达，而且增强mRNA稳定性[7]。Schnabl等[8]用从大鼠分离的HSC分别用表达TAK1的腺病毒载体、JNK特异性阻断剂阻断JNK通路，P38MAPK特异性阻断剂阻断P38MAPK信号通路，发现阻断P38MAPK后可使α1（Ⅰ）型胶原mRNA的表达降低，但使HSC增殖较明显，而JNK信号通路一定程度上调控了HSC激活、生长调节及胶原的合成。Anania等[9]研究证实阻断JNK活性后可抑制HSC内α2（Ⅰ）型胶原的表达。由此本课题组推测H2S可能通过P38MAPK信号通路对HSC起作用，从而对Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达有影响。

在涉及多种细胞的凋亡反应中核因子-κB（nu⁃clear factor kappa B，NF-κB）是HSC最重要的抗凋亡因子，抑制NF-κB能够影响HSC的激活，许多研究证实它在肝纤维化的发生、发展中起重要作用[10]。Schwabe等[11]研究发现NF-κB不但能够抑制肝细胞凋亡，同时抑制HSC凋亡，还可促进其增殖。沈钦海等[12]证实外源性硫化氢可抑制NF-κB表达，促进激活的HSC凋亡。由于NF-κB可直接参与调节胶原蛋白的表达[13]，故抑制其活性可能具有直接减少ECM合成的作用。

本实验结果显示，给予P38MAPK阻断剂SB203580，H2S刺激的HSC凋亡率明显高于仅给予通路抑制剂组，提示H2S可能与P38MAPK信号通路有关，将SB203580与NaHS（H2S）同时作用于HSC时，或许引起两药物发生某种化学反应，使H2S增加了SB203580的药物敏感性，从而促进凋亡。当外源性给予H2S供体NaHS后，阻断P38MAPK可使HSC内Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达明显降低，未给予抑制剂的NaHS可促进HSC增殖，增加Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达，此结果与Schnabl等[8]研究结果相似，证实了H2S通过P38MAPK信号通路参与调节HSC内Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达。推测H2S通过激活P38MAPK信号通路作用于HSC，HSC活化伴随NF-κB激活，活化的NF-κB通过抑制肝细胞凋亡且促进HSC增殖，引起ECM增多，胶原是ECM的最主要成分，从而引起Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达增高。由于课题组前期研究结果已证实H2S对肝纤维化具有保护作用，胶原蛋白的最终表达才能对肝纤维化起明显指示作用，那么翻译过程中是否由于某种机制使高表达的mRNA翻译为低表达的蛋白质而使胶原产生减少，从而起到抗肝纤维化作用；且本实验仅研究H2S对HSC的作用，H2S对肝细胞是否也能够促增殖产生胶原使其高表达，其具体作用机制还尚未可知。在此需要注意的是，上述研究结果提示阻断P38MAPK信号通路可以明显抑制H2S刺激的HSC增殖，促进其凋亡，这与Schnabl等[8]的研究结果又有所不同，考虑可能与如下原因有关：MAPK信号通路包括P38、ERK和JNK等，本实验仅用SB203580阻断P38MAPK信号通路，这是否是由于P38MAPK信号通路与细胞内其他信号通路产生交叉反应，又或者MAPK信号通路各分支间存在协同或干扰效应，具体机制尚需进一步研究。

Figure 1 Changes in cell morphology under inverted microscope(×200)图1 倒置显微镜下观察细胞形态变化（×200）

Figure 2 Comparison of apoptotic rates in HSC T6 cells between groups图2 各组HSC-T6细胞凋亡率的比较

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