西维来司钠对脑出血模型大鼠脑组织损伤的保护作用研究

黄艳，王波，董志，杨洪波，何科容（.重庆市南川区人民医院，重庆408400；2.重庆医科大学，重庆 40006）

脑出血（Cerebral hemorrhage）是严重危害老年人的一种常见病、多发病，且发病率、死亡率和致残率均较高，是急性脑血管病中的危重类型[1]。脑出血时，除了血肿的占位性病变外，患者还会出现一系列继发性脑损伤，如脑水肿、缺血、炎症反应、血肿周围组织能量代谢紊乱及氧自由基损伤等[2-3]。由于脑出血病理生理机制复杂，其病因学尚未完全清楚，多数患者仍然以内科保守治疗为主，至今还没有特效的治疗方法[4]。西维来司钠（Sivelestat sodium）是一种小分子中性粒细胞弹性蛋白酶（Neutropil elastase，NE）抑制剂，能选择性抑制NE，可用于急性肺损伤的治疗。近年国外有研究报道西维来司钠能够改善脑缺血/再灌注引起的脑水肿、脑损伤及炎症反应[5]，能减轻呼吸系统疾病的炎症反应[6]。但西维来司钠对脑出血引起的脑组织损伤是否也有保护作用，目前国内外少见相关报道。本研究选用目前最常用且建模成功率较高的胶原酶诱导建立脑出血模型，探讨西维来司钠对脑出血模型大鼠脑组织的保护作用及机制。

1 材料

1.1 仪器

大鼠脑主体定位仪（国营西北光学仪器厂）；电子分析天平（德国Sartorius公司）；低温离心机（美国Sigma公司）；紫外分光光度计（上海光电医用仪器有限公司）；BI2000免疫组化分析系统（成都泰盟科技公司）。

1.2 药品与试剂

Ⅶ型胶原酶（美国Sigma公司，批号：C0130，含量：0.25～1.0 U/mg）；水合氯醛（苏州正兴化工厂，批号：070120，分析纯）；西维来司钠（重庆医药工业研究院，批号：070310，纯度：99.5%）；一氧化氮（NO）试剂盒、髓过氧化物酶（MPO）试剂盒和免疫组化试剂盒（南京建成科技有限公司）；核转录因子κB（NF-κB）抗体（北京中山生物技术有限公司）；NE酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（上海雅吉生物科技有限公司）。

1.3 动物

健康Wistar大鼠40只，清洁级，♂，体质量200～250 g，购自重庆医科大学实验动物中心，使用许可证号：SCXK（渝）2007-0001。

2 方法

2.1 分组与建模

40只大鼠适应性喂养3 d后，随机分为假手术组、模型组和西维来司钠高、中、低剂量组，每组8只。除假手术组外，其余各组大鼠参考Rosenberg GA等[7]的方法建立脑出血模型，建模手术后各组大鼠分笼饲养。假手术组和模型组大鼠于建模前30 min分别经尾静脉缓慢给予0.9%氯化钠注射液（生理盐水），西维来司钠高、中、低剂量组大鼠分别同法给予200、80、30 mg/kg的西维来司钠溶液[8]。

2.2 标本的收集与处理

各组大鼠术后24 h经水合氯醛麻醉后快速断头取脑，分离血肿周围脑组织和血肿脑组织，精确称质量，置于－70℃保存备用。测定时，将血肿周围脑组织用生理盐水在冰浴环境内以玻璃匀浆器制成10%的脑组织匀浆。

2.3 血肿周围脑组织中NE、NO及MPO含量的测定

取各组大鼠10%的血肿周围脑组织匀浆，4℃下12000×g离心5 min，取上清液待测。采用双抗体夹心ELISA法，按相应试剂盒说明书操作测定血肿周围脑组织中NE、NO及MPO含量。

2.4 血肿脑组织中NF-κB表达的检测

采用免疫组化法，将各组大鼠的血肿脑组织切片放入4%的多聚甲醛中，固定24 h后经乙醇梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，连续冠状切片；将组织切片粘贴于经多聚赖氨酸处理过的载玻片上，免疫组化染色，按照试剂盒说明书操作。显微镜下观察并照相，以组织中有明显二氨基联苯氨（DAB）棕褐色染色者判断为阳性。采用BI2000免疫组化分析系统进行阳性细胞计数，计算4个视野的阳性细胞平均数。

2.5 统计学分析

3 结果

3.1 血肿周围脑组织中NE、NO及MPO的含量变化

与假手术组比较，模型组大鼠血肿周围脑组织中NE、NO及MPO含量均明显增加（P＜0.01）；与模型组比较，西维来司钠高、中剂量组大鼠血肿周围脑组织中NE、NO及MPO含量均明显减少（P＜0.05或P＜0.01），西维来司钠低剂量组大鼠上述指标差异无统计学意义（P＞0.05）。各组大鼠血肿周围脑组织中NE、NO、MPO的含量变化见表1。

3.2 血肿脑组织中NF-κB的表达变化

假手术组大鼠脑组织内几乎无NF-κB表达。与假手术组比较，模型组大鼠血肿脑组织中NF-κB表达明显增强（P＜0.01）；与模型组比较，西维来司钠高、中剂量组大鼠血肿脑组织中NF-κB表达均明显减弱（P＜0.01或P＜0.05），西维来司钠低剂量组大鼠该指标差异无统计学意义（P＞0.05）。各组大鼠血肿脑组织中NF-κB表达的显微镜图见图1，结果见表1。

表1 各组大鼠血肿周围脑组织中NE、NO、MPO的含量和血肿脑组织中NF-κB表达变化（±s，n＝6）Tab 1 The contents of NE，NO and MPO in cerebral tissue around the hematoma and the expression of NF-κB in cerebral tissue of rats in each grou（p±s，n＝6）

表1 各组大鼠血肿周围脑组织中NE、NO、MPO的含量和血肿脑组织中NF-κB表达变化（±s，n＝6）Tab 1 The contents of NE，NO and MPO in cerebral tissue around the hematoma and the expression of NF-κB in cerebral tissue of rats in each grou（p±s，n＝6）

与假手术组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01vs.sham operation gruop：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

NF-κB，个/4个视野1.50±1.2925.00±6.48＊8.25±3.40##14.25±6.80#20.25±6.70组别假手术组模型组西维来司钠高剂量组西维来司钠中剂量组西维来司钠低剂量组NE，ng/ml 0.356±0.0432.398±0.324＊1.353±0.294#1.696±0.325#2.128±0.190 NO，μmol/g prot 1.56±0.263.13±0.17＊2.04±0.21##2.43±0.31##3.00±0.25 MPO，U/g 0.063±0.0160.291±0.022＊0.196±0.023##0.243±0.019##0.278±0.023

图1 各组大鼠血肿脑组织中NF-κB表达的显微镜图（×400）A.假手术组；B.模型组；C.西维来司钠高剂量组；D.西维来司钠中剂量组；E.西维来司钠低剂量组Fig 1 The expression of NF-κB in cerebral tissue of rats in each group by microscope（×400）A.sham operation group；B.model group；C.sivelestat sodium highdose group；D.sivelestat sodium medium-dose group；E.sivelestat sodium low-dose group

4 讨论

NE是一种内源性蛋白酶，生理情况下位于中性粒细胞嗜苯胺蓝颗粒中，主要参与对革兰阴性杆菌的杀灭作用；同时它也参与中性粒细胞迁移，促进炎症因子如白细胞介素2（IL-2）、IL-6、IL-8等的表达，调节炎症反应，因此它对于机体防御功能非常重要。但在炎症情况下，激活的中性粒细胞释放大量的NE至细胞外，引起弹性蛋白、蛋白多糖和胶原等的降解，从而导致组织、细胞和血管基底膜损伤。国外研究报道NE与大鼠脑缺血/再灌注引起的脑损伤有关，用西维来司钠治疗可以明显改善脑组织损伤，其作用机制可能与其减少NE的生成有关[5]。在正常情况下，NO作为一种血管舒张因子参与脑血管舒缩的调节，而高浓度的NO却是神经细胞损伤的毒性分子[9]。本研究显示模型组大鼠表现出典型的脑出血病理学改变，证明建模是成功的，模型组大鼠血肿周围脑组织中NE、NO含量较假手术组明显增加。NE抑制剂西维来司钠处理不仅能降低模型大鼠血肿周围脑组织中炎症细胞浸润，减轻神经细胞损伤，还能减少NE、NO含量，并与剂量呈正相关。这表明西维来司钠对脑出血模型大鼠的脑组织具有保护作用，其机制可能与抑制NE、NO的生成有关。

NF-κB是一种重要的细胞核转录调节因子，它广泛参与炎症反应、肿瘤细胞的增殖与凋亡及人类的多种疾病。本研究发现脑出血后血肿周围组织NF-κB表达增加、MPO含量明显增加，这两者之间存在紧密联系。结合前人的实验研究结果我们可以推测ICH大鼠脑内MPO含量的增加是由于NF-κB表达增强，引起细胞间黏附分子1（ICAM-1）表达增加[10]，从而导致大量炎症细胞浸润。本研究显示西维来司钠能呈剂量正相关地降低大鼠血肿脑组织中NF-κB表达、降低MPO含量，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。

综上所述，西维来司钠对脑出血模型大鼠的脑组织有明显的保护作用，其机制可能与NE、NO、MPO含量减少及NF-κB表达减弱有关。

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