川芎嗪对CIA大鼠足爪组织MMP-13蛋白表达及血清VEGF、IL-17和IL-23水平的影响*

田 华， 张松峰， 芦 琨， 母传贤， 沈永杰

(商丘医学高等专科学校1生物化学与分子生物学教研室，2临床医学系，河南商丘476100)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种自身免疫性疾病，其主要病理特点是滑膜细胞增生，衬里层增厚，多种炎症细胞浸润，血管翳形成，以及软骨和骨组织破坏，最终导致关节畸形和功能丧失，但其确切机制目前未明。近年研究发现细胞因子［1］网络失衡和基质金属蛋白酶［2］在RA的发生、炎症迁延、关节的破坏中占有重要的地位。川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)有抗肿瘤血管生成作用［3］，并能抑制血管内皮细胞的增殖和抗炎作用早已得到证实，但是其机制还不甚清楚。本实验在成功地建立胶原性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠模型的基础上，通过检测大鼠血清中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factors，VEGF)、白细胞介素 17(interleukin 17，IL-17)和白细胞介素23(interleukin 23，IL-23)水平以及足爪皮下组织中基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13，MMP-13)的表达，探讨TMP治疗 CIA大鼠的可能机制，为临床使用TMP治疗RA提供新的理论依据和实验数据。

材料和方法

1 动物

Sprague-Dawley(SD)大鼠50只，雌雄各半，重约(180±20)g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，许可证号为SCXK(鄂)2012-0007。

2 主要试剂

磷酸川芎嗪片，无锡市第七制药厂生产，规格:50 mg×100片，批号为030201;地塞米松盐酸注射液(5 g·L－1)购自河南确山龙渊药业有限公司。弗氏完全佐剂和鸡Ⅱ型胶原由上海本草生物医学工程所提供;多聚赖氨酸，Sigma生产;冰醋酸，广州化学试剂二厂生产。VEGF、IL-17和IL-23试剂盒，南京建成生物工程研究所提供;MMP-13小鼠单克隆抗体免疫组化S-P试剂盒(北京中山公司)，兔抗大鼠MMP-13单克隆抗体、兔抗大鼠GAPDH单克隆抗体、IP细胞裂解液和ECL化学发光试剂盒均为碧云天生物技术研究所产品。

3 主要方法

3．1 实验动物分组及用药 实验分组:实验用大鼠50只，按统计学方法随机分为正常对照组10只和CIA模型组40只。模型复制方法:将鸡Ⅱ型胶原15 mg 溶于7．5 mL 预先配制好的0．1 mol·L－1醋酸中，鸡Ⅱ型胶原浓度为2 g·L－1，共7．5 mL，于4 ℃过夜充分溶解。次日，与弗氏完全佐剂等体积于冰浴中混合并使之充分乳化，制成稳定的乳化剂15 mL(每mL含1 mgⅡ型胶原，置4℃冰箱保存备用)。在大鼠的左后肢足跖皮下注射0．1 mL致炎，第7天在大鼠尾、背多点皮下注射0．1 mL该胶原乳剂作为激发注射。正常对照组在同一部位同样方法注射0．1 mL生理盐水。造模后发现36只大鼠左足红肿明显，体积增大，说明造模成功，成功率为90%。将造模成功的36只大鼠随机分为模型对照组、地塞米松治疗组及 TMP 100 mg·kg－1及 50 mg·kg－1治疗组，每组 9只。TMP组大鼠于造模后第7～35天ig给予TMP 100 mg·kg－1和50 mg·kg－1，每天用药1 次;地塞米松治疗组ig给予2 mg·kg－1，每天用药1次;正常对照组和模型对照组ig给予2 mL·kg－1生理盐水，每天用药1次。

3．2 CIA大鼠体重测定 在致炎前(第0天)及致炎后第7、14、21、28和35天分别测量各组大鼠体重。3．3 血清细胞因子测定 实验第36天向CIA大鼠腹腔内注射3%巴比妥钠0．3～0．4 mL麻醉。剪开大鼠腹腔，10 mL注射器心脏取血，室温静置1 h，3 000 r/min离心15 min，吸取上层血清。用ELISA测定法(按试剂盒说明书进行操作)测定CIA大鼠血清中VEGF、IL-17和IL-23的含量。

3．4 病理切片 于制模第36天取下大鼠足跖部位的组织，用10%中性缓冲甲醛及时固定，石蜡包埋，切片，HE染色。

3．5 MMP-13 蛋白表达

3．5．1 免疫组化染色检测 (1)取大鼠左足跖部位的组织，依次进行10%中性缓冲甲醛固定、石蜡包埋、切片、贴片(载玻片预先用多聚赖氨酸浸泡，捞片后于60℃加热60 min，以使切片紧密贴附)及常规脱蜡至水后置 0．1 moL·L－1PBS(pH 7．4)中浸泡 5 min。(2)将切片浸入0．01 moL·L－1(pH 6．0)柠檬酸盐缓冲液中，于微波炉中加热至100℃、持续5 min，反复2次。室温自然冷却后，用0．1 moL·L－1PBS洗涤5 min×2次。(3)滴加封闭液羊血清置室温20 min，甩去多余的液体。(4)滴加1∶50羊抗MMP-13抗体，阴性对照以PBS代替Ⅰ抗，于4℃孵育过夜，以0．1 moL·L－1PBS洗涤5min×3次。滴加生物素标记Ⅱ抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗5 min×2次。(5)滴加链霉抗生物素－过氧化物酶溶液、室温孵育10 min，同前述。(6)滴加试剂streptavidin-biotin complex(SABC)，于37℃孵育30 min，用PBS冲洗5 min×3次。(7)二氨基联苯胺显色:使用DAB显色试剂盒，取1 mL蒸馏水，加试剂盒中试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，自来水冲洗。(8)滴加苏木素轻度复染后，依次进行脱水、透明、中性胶封片及显微镜观察。

3．5．2 结果判断 以胞浆中出现淡黄至褐黄色细颗粒状着色者为阳性细胞。在光学显微镜下，每只动物随机计数500个细胞，计算每组的阳性表达率，同时记录染色强度，淡黄色为弱阳性(+)，棕黄色为中等阳性(++)，棕褐色为强阳性(+++)，不着色为阴性(－)。

3．5．3 Western bloting检测 取0．1 g大鼠左足跖部位的组织加入1 mL裂解液匀浆，12 000×g离心5 min，取上清液测蛋白浓度。将上清液与6×loading buffer混合后，沸水浴加热5 min，离心取上清。于4℃凝胶电泳，电转移1 h至硝酸纤维膜，用5%脱脂奶粉溶液4℃封闭过夜，加入兔抗大鼠MMP-13抗体(工作浓度1∶1 000)室温孵育1．5 h，PBS/T 洗膜3 ×10 min，加入HRP标记的Ⅱ抗(工作浓度1∶5 000)室温孵育膜1 h，PBS/T洗膜4×15 min。曝光底片，扫描保存为电脑文件，用Gel-Pro Analyzer 4．0软件将条带的灰度值数字化。以GAPDH作内参照，目的条带与其相比得到相对量。

4 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 11．6统计软件进行分析，进行单因素方差分析，方差齐时，各组间两两比较采用LSD-t检验，方差不齐时，各组间两两比较采用Tamhance’s T2检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1 TMP对CIA大鼠体重的影响

CIA组大鼠于造模后第7天表现为食欲下降、体重减轻、活动减少、精神倦怠、明显消瘦，与正常组大鼠相比差异显著(P＜0．01);TMP(100 mg· kg－1)和地塞米松给药14 d后可有效抑制CIA大鼠体重的减轻，与CIA组比较差异有统计学意义(P＜0．01)，而CIA+TMP(50 mg· kg－1)组与模型对照组比较无明显效果，见表1。

表1 TMP对CIA大鼠体重的影响Table 1．Effect of TMP on body weight of CIA rats(g．Mean±SD．n=9～10)

2 TMP对CIA大鼠血清VEGF、IL-17和IL-23含量的影响

CIA组血清VEGF、IL-17和IL-23的含量均较正常组大幅度上升，分别上升了50．00%、62．22%和82．41%(P ＜0．01);与 CIA 组比较 CIA+TMP(100 mg·kg－1)组血清 VEGF、IL-17和 IL-23的含量明显降低，分别降低了 33．33%、27．40%和 33．33%(P ＜0．01);与CIA组比较，地塞米松组血清VEGF、IL-17和IL-23的含量亦明显降低，分别降低了30．77%、30．14%和 37．25%(P ＜ 0．01);而 CIA+TMP(50 mg·kg－1)治疗组与CIA组比较血清 VEGF、IL-17和IL-23的含量无明显变化，见表2。

表2 TMP对各组大鼠血清VEGF、IL-17和IL-23含量的影响Table 2．Effect of TMPon the content of serum VEGF，IL-17 and IL-23 in CIA rats(μg/L．Mean±SD．n=9～10)

3 TMP对CIA大鼠足爪组织病理改变的影响

正常组大鼠足爪皮下组织细胞排列规则，无炎症细胞浸润及血管新生;CIA组大鼠足爪皮下组织细胞排列紊乱，有大量炎症细胞浸润，血管增生明显;TMP(100 mg·kg－1)和地塞米松均能明显改善CIA大鼠足爪病理改变，皮下组织细胞排列较规则，亦明显抑制炎症细胞浸润及血管增生现象;CIA+TMP(50 mg· kg－1)组大鼠足部皮肤的病理状况无明显变化，见图1。

Figure 1．Effect of TMP on the histopathological changes of the paw tissues in CIA rats(×400)．A:normal group;B:CIA group;C:CIA+dexamethasone group;D:CIA+TMP(50 mg· kg－1)group;E:CIA+TMP(100 mg·kg－1)group．图1 TMP对CIA大鼠足爪组织病理改变的影响

4 TMP对 CIA大鼠足爪组织中MMP-13蛋白表达的影响

4．1 免疫组化 MMP-13蛋白表达的阳性部位主要在胞浆中，在高倍镜下可见胞浆内有棕黄色的小颗粒。在正常组胞浆内几乎未见阳性染色区域;而CIA组胞浆染色呈棕黄色，MMP-13蛋白表达呈强阳性;CIA+TMP(100 mg·kg－1)和地塞米松组胞浆内略见棕黄色的小颗粒，与CIA组比较差异显著(P＜0.05);CIA+TMP(50 mg·kg－1)组胞浆内 MMP-13阳性表达与CIA组相比无显著差异，见图2、表3。

Figure 2．Effect of TMP on MMP-13 protein expression in the paw tissues of CIA rats(SABC，×400)．A:normal group;B:CIA group;C:CIA+dexamethasone group;D:CIA+TMP(50 mg· kg－1)group;E:CIA+TMP(100 mg·kg－1)group．图2 TMP对CIA大鼠足爪组织中MMP-13表达的影响

4．2 Western blotting CIA组大鼠足爪组织MMP-13蛋白表达量约为正常组的2倍;与CIA组比较，CIA+TMP(100 mg·kg－1)组 MMP－13表达降低了31．82%(P ＜ 0.01)，而 CIA+TMP(500 mg·kg－1)组MMP-13表达基本上无变化;经地塞米松治疗后，MMP-13 表达降低了30．01%(P ＜0．01)，见图3。

表3 各组大鼠足爪组织中MMP-13蛋白阳性表达率Table 3．Positive rates of MMP-13 expression in the paw tissues of CIA rats detected by immunohistochemistry(%．Mean±SD．n=9～10)

Figure 3．Effect of TMP on MMP-13 expression in the paw tissues of CIA rats determined by Western blotting assay．A:normal group;B:CIA group;C:CIA+dexamethasone group;D:CIA+TMP(50 mg· kg－1)group;E:CIA+TMP(100 mg·kg－1)group．Mean±SD．n=9～10．#P ＜0．05 vs normal group;△△P ＜0．01 vs CIA group．图3 TMP对CIA大鼠足爪组织MMP-13蛋白表达的影响

讨 论

本实验用Ⅱ型胶原诱导CIA大鼠模型，模型对照组大鼠逐渐出现食欲下降、体重减轻、活动减少、精神倦怠、明显消瘦等现象;TMP(50 mg·kg－1)治疗组用药后，CIA大鼠一般状况与模型对照组比较无明显减轻，而TMP(100 mg·kg－1)剂量能明显提高CIA大鼠食欲，增加CIA大鼠活动量，抑制CIA大鼠消瘦，增加其体重，改善CIA大鼠的精神状况，表明TMP(100 mg·kg－1)对CIA有一定的治疗效果。在此基础上我们进一步探讨了TMP治疗RA的可能机制。TMP是中药川芎的有效成分之一，属酰胺类生物碱，化学结构为四甲基吡嗪，有抗肿瘤血管生成、抑制血管内皮细胞的增殖、抗血小板聚集和抗炎等作用，目前已广泛应用于临床，是现代中西医治疗RA的常用药，但其作用机制尚不十分明确。

RA主要表现为关节滑膜的慢性炎症、滑膜血管翳形成，关节软骨破坏，最终导致关节畸形、功能丧失。关节局部炎症细胞的浸润及其分泌的炎症因子、酶等在RA关节炎性破坏中发挥重要作用［4］。

成纤维样滑膜细胞过度增殖以及滑膜血管新生是RA滑膜炎和关节破坏的最主要原因［5］。VEGF是促进血管形成最重要的细胞因子，不仅促进了RA滑膜血管翳形成，而且也是RA发病过程中的直接促炎因子。Nagashima等［6］发现，VEGF在巨噬样滑膜衬里细胞、血管平滑肌细胞和关节软骨细胞中均有表达。IL-23是新近发现的一种异源二聚体细胞因子，近期研究发现RA患者滑膜组织中IL-23 p19 mRNA和蛋白表达明显增高［7］。自然杀伤(natural killer，NK)细胞是机体重要的免疫细胞，参与一些自身免疫性疾病的发生，其表面有IL-23受体［8］。IL-23通过结合NK细胞膜表面IL-23受体复合物，通过胞内信号转导系统(如JAK2、STAT3)诱导细胞激活［8］，活化的NK细胞可合成和分泌多种细胞因子，如TNF-α、TNF-β等，也可直接刺激 CD4+T细胞激活分泌IL-17等。IL-17是由促进关节炎症的免疫细胞产生的一种强大的前炎症细胞因子，也是炎症反应的微调因子，可以刺激成纤维细胞、角质细胞、上皮及内皮细胞释放 IL-6、IL-8、前列腺素 E2(prostaglandin E2，PGE2)、基质金属蛋白酶、单核细胞化学趋化蛋白和粒细胞集落刺激因子等细胞因子。IL-17还可诱导人成纤维细胞表达细胞间黏附分子1，促进T细胞增殖。IL-17能够与多种细胞因子产生协同作用，以放大炎症反应。在RA发病过程中，IL-17不仅可诱发人滑膜细胞产生GM-CSF和PGE2［9］，还可以通过PI3K途径激活NF-κB，进而促进成纤维细胞释放大量炎症因子IL-6和IL-8［10］，诱导滑膜细胞分泌VEGF、肝细胞生长因子等多种促进血管生成的细胞因子。我们的研究证实，TMP(100 mg· kg－1)可明显降低CIA大鼠血清中VEGF、IL-17和IL-23的含量。基质金属蛋白酶几乎能降解所有细胞外基质成分，还可激活其它基质金属蛋白酶，形成瀑布效应。MMP-13是基质金属蛋白酶的一种，又名间质胶原酶，可以降解细胞外基质中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ及Ⅺ型胶原纤维，而这些成分也是关节软骨的重要组成成分，在 RA 发病中起着重要作用［11］。同时，Kim 等［12］研究证实MMP-13在RA关节骨及软骨的破坏中发挥重要作用。而我们的实验同样证明，TMP(100 mg·kg－1)可明显下调CIA大鼠足爪皮下组织中MMP-13蛋白的表达，抑制CIA大鼠足爪皮下组织炎症细胞浸润剂血管增生。本研究中地塞米松与TMP(100 mg· kg－1)对CIA大鼠的治疗效果都比较理想，但地塞米松为糖皮质激素类药物，长期使用易导致患者对激素的依赖性，食欲亢进，体重增加，面部及颈背部皮下脂肪增厚，胃及十二指肠溃疡，胃肠出血，继发感染、高血压、糖尿病、肌肉无力、骨质疏松等全身的不良反应。而TMP药物毒性低，避免了诸多药物副作用。