新型融合多肽HTPP-MDC体外抑制HBV复制活性及亚细胞定位*

卢雪梅， 黄演婷， 汪 洁， 金小宝， 朱家勇△

(1广东药学院药用生物活性物质研究所，广东省生物活性药物研究重点实验室，广东广州510006;2南方医科大学公共卫生与热带医学学院，广东广州510515)

穿膜肽是一类能够穿透细胞膜进入细胞质甚至细胞核而不损坏细胞膜结构的小分子多肽，它的长度一般不超过30个氨基酸。近几年的研究证实，穿膜肽能运载一系列具有不同生物学活性的物质进入活细胞内，包括蛋白、多肽、核酸和寡聚核苷酸等［1］，为分子靶向诊断和治疗提供了新的思路。肝细胞靶向穿膜肽(hepatocyte-targeting and cell-penetrating peptide，HTPP)来源于恶性疟原虫环子孢子蛋白，研究发现其不但可特异性结合肝细胞表面的受体从而靶向肝脏［2］，同时还能够有效穿透肝细胞膜，快速进入肝细胞内部［3-4］，有望成为新型双功能小分子穿膜肽。我们课题组以HTPP为靶向穿膜部位，家蝇天蚕素(Musca domestica cecropin，MDC)作为抗病毒作用部位，将二者在分子水平进行了融合，构建了新型肝靶向穿膜融合多肽 HTPP-MDC［5-6］。HTPP-MDC有望成为高效结合、定位准确和靶向杀伤的新型生物导弹药物，对降低乙型肝炎病毒感染引起的肝脏疾病的发病率和死亡率具有深远意义。

我们在前期研究中利用基因重组技术将HTPP与MDC进行了融合［5］，并通过大肠杆菌表达系统成功表达了 HTPP-MDC［6］，本文主要在研究 HTPPMDC对乙型肝炎体外模型HepG2．2．15细胞株和人正常肝细胞Chang liver细胞株毒性作用的基础上，探讨HTPP-MDC对HepG2．2．15细胞乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)、乙型肝炎病毒 e抗原(hepatitis B virus e antigen，HBeAg)分泌和乙型肝炎病毒DNA(hepatitis B virus DNA，HBV DNA)复制的影响及其在肝细胞中的定位，初步验证 HTPP-MDC抗 HBV作用，为 HTPPMDC的临床应用提供实验依据。

材料和方法

1 材料

1．1 主要仪器 荧光定量PCR仪和酶标仪，Bio-Rad产品;二氧化碳培养箱，Thermo Forma产品;高速冷冻离心机，Eppendorf产品;倒置相差显微镜，Leica产品;激光共聚焦显微镜，Olympus产品。

1．2 细胞株与主要试剂 HepG2．2．15细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心;胎牛血清和DMEM培养基购自HyClone;G418购自Beyotime;四甲基偶氮唑盐(MTT)购自Sigma;HBsAg ELISA试剂盒和HBeAg ELISA试剂盒购自上海科华生物技术有限公司;HBV DNA荧光定量检测试剂盒购自中山大学达安基因有限公司;蛋白异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记试剂盒购自上海生工;HTPP-MDC为本实验室原核表达产物。其它化学试剂为进口或国产分析纯。

2 方法

2．1 细胞的复苏与传代 细胞培养于高糖DMEM培养基中(含10% 胎牛血清，pH 7．2)，于200 mg/L G418培养基定期筛选。培养条件为95% ～98% 相对湿度、5%CO2、37℃。2～3 d换液1次，细胞生长到70% ～80%时消化(含EDTA的 0．25%胰蛋白酶)传代。实验前细胞密度调整为1×109/L，台盼蓝检测活力大于85%。

2．2 HTPP-MDC对细胞株的毒性作用检测 将对数生长期的乙型肝炎体外模型HepG2．2．15细胞和人正常肝细胞株Chang liver细胞各按1×108/L接种96孔细胞培养板，每孔200μL，37℃培养过夜，弃上清后加入200μL含不同浓度HTPP-MDC培养基(终浓度为 3．125、6．25、12．5、25、50 μmol/L)，同时设不加药物的对照组，每个浓度设4个平行孔。每24 h换相应浓度新鲜培养基，72 h后每孔加100μL MTT溶液(5 g/L)，继续培养4 h后每孔加入100μL DMSO溶液，振荡溶解后，570 nm处比色测定。按下式计算药物作用下的细胞存活率:

细胞存活率(%)=药物处理孔A值 ÷对照孔A值×100%。

2．3 HTPP-MDC干预实验 将对数期 HepG2．2．15细胞按每孔1×105个接种于24孔细胞培养板中，37℃培养过夜后换含药新鲜培养基(2% 胎牛血清)，其中 HTPP-MDC 终浓度分别为1．25、2．5、5 μmol/L，以4 mg/L拉米夫定(lamivudine，LMV)为阳性对照，生理盐水为阴性对照，不含药物孔为空白对照，每个浓度设4个平行孔。实验设计为时间依从性，加药后每3 d收集上清液1次，再加入新的含药培养基，共孵育9 d。收集的第3天、第6天和第9天上清液于－20℃保存，用于HBsAg、HBeAg与 HBV DNA检测。

2．4 HBsAg和HBeAg检测 采用ELISA试剂盒按试剂说明书检测HBsAg和HBeAg，按下式计算HTPP-MDC对HepG2．2．15细胞分泌 HBsAg和 HBeAg的抑制率:

抑制率(%)=(空白对照孔 A值－实验孔A值)/空白对照孔A值×100%。

2．5 HBV DNA测定 HBV DNA定量标准品由达安基因公司直接提供，按HBV DNA荧光定量PCR检测试剂盒说明书提取样品DNA，取样本2μL为模板，并同时设立阴性对照、临界阳性对照和强阳性对照，各反应管放入荧光定量PCR仪，按以下条件进行扩增:93℃预变性2 min;93℃ 45 s，55℃ 1 min，10个循环;93℃ 30 s，55℃ 45 s，30个循环。然后计算样本HBV DNA拷贝数。

2．6 激光共聚焦技术研究HTPP-MDC在细胞中的定位 采用蛋白FITC标记试剂盒标记重组蛋白，具体操作为:将重组蛋白冻干粉用PBS溶解并与FITC(激发波长为490 nm，发射波长为525 nm)混合，室温避光作用5 h，过凝胶柱纯化，去掉未结合的FITC。制备HepG2．2．15细胞爬片，加入FITC标记的HTPP-MDC，室温作用10 min，用PBS洗涤4次，封片后用激光共聚焦显微镜观察HTPP-MDC的细胞定位情况。

3 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示，应用SPSS 11．5统计软件进行分析，组间均数比较采用单因素方差分析，以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1 HTPP-MDC对细胞的毒性作用

不同浓度HTPP-MDC处理HepG2．2．15细胞和Chang liver细胞的存活率见表1。HTPP-MDC在3.125～50μmol/L浓度范围内，对正常肝细胞活力无影响。HTPP-MDC的浓度≤6.25μmol/L时，HepG2．2．15细胞存活率＞95%，为药物作用浓度的安全范围。

表1 HTPP-MDC 对 HepG2．2．15和Chang liver细胞活力的影响Table 1．Effects of HTPP-MDCon the viability of HepG2．2．15 cells and Chang liver cells(Mean±SD．n=4)

2 HTPP-MDC 对 HepG2．2．15细胞分泌 HBsAg和HBeAg的影响

HTPP-MDC 对 HepG2．2．15细胞分泌 HBsAg和HBeAg抑制作用见图1、2。当HTPP-MDC作用3 d后，不同浓度的 HTPP-MDC对 HepG2．2．15分泌HBsAg和HBeAg均具有显著抑制作用(P＜0．01)。在相同浓度下，HTPP-MDC随其作用时间的延长，抑制率亦增加;同一时点，随着HTPP-MDC浓度的增加，抑制率随之增加。HTPP-MDC的作用表现出显著的量效与时效关系。

Figure 1．Inhibitory effect of HTPP-MDC on HBsAg secretion in HepG2.2.15 cells．LMV:lamivudine;HTPP-MDC:hepatocyte-targeting and cell-penetrating peptide -Musca domestica cecropin．Mean ± SD．n=4．＊＊P ＜0.01 vs control group．图1 HTPP-MDC对Hep G2．2．15细胞分泌HBsAg的抑制作用

Figure 2．Inhibitory effect of HTPP-MDC on HBeAg secretion in HepG2.2.15 cells．LMV:lamivudine;HTPP-MDC:hepatocyte-targeting and cell-penetrating peptide-Musca domestica cecropin．Mean ± SD．n=4．＊＊P ＜0.01 vs control group．图2 HTPP-MDC对HepG2．2．15细胞分泌HBeAg的抑制作用

3 HTPP-MDC 对 Hep G2．2．15 细胞 HBV DNA 复制的影响

HTPP-MDC对 HepG2．2．15细胞 HBV DNA 复制的抑制作用见图3。荧光定量PCR检测各浓度HTPP-MDC 对 HepG2．2．15 细胞作用 3、6 和 9 d后上清液中HBV DNA的拷贝数，结果显示当HTPPMDC作用3 d后，HTPP-MDC对HepG2.2．15细胞分泌到上清中的HBV DNA均有显著抑制作用(P＜0.01)，并且抑制程度依赖于药物的处理浓度。

4 激光共聚焦技术研究HTPP-MDC在细胞中的定位

将重组 HTPP-MDC进行 FITC标记，与HepG2．2．15细胞孵育10 min后，激光共聚焦显微镜观察可见细胞内充满绿色荧光，提示HTPP-MDC已经透过细胞膜进入HepG2．2．15细胞内部，见图4。

讨 论

HepG2．2．15细胞是将完整双拷贝的乙型肝炎病毒基因转染到人肝癌细胞株 HepG2细胞中，经G418筛选得到的肝胚瘤细胞系［7］。该细胞能稳定分泌HBsAg、HBeAg及 Dane颗粒，并可在细胞内检测到cccDNA，是目前体外研究乙肝病毒的复制规律和筛选抗乙肝病毒药物的理想细胞模型［8］。本实验以体外培养 HepG2．2．15细胞为研究对象，研究HTPP-MDC体外抗 HBV活性。结果证实HTPP-MDC在一定浓度范围内对HepG2．2．15细胞没有毒性作用，并且显著抑制 HepG2．2．15细胞 HBsAg、HBeAg的分泌和HBV DNA复制，具有明显的量效与时效关系。这说明我们课题组设计的HTPP-MDC具有明确的体外抗HBV活性。

Figure 3．Inhibitory effect of HTPP-MDC on HBV DNA replication in HepG2．2．15 cells．LMV:lamivudine;HTPPMDC:hepatocyte-targeting and cell-penetrating peptide-Musca domestica cecropin．Mean±SD．n=4．＊＊P ＜0.01 vs control group．图3 HTPP-MDC对 HepG2．2．15细胞 HBV DNA 复制的抑制作用

Figure 4．Evaluation of cell penetrating activity of HTPP-MDCin HepG2．2．15 cells by confocal microscope detection．图4 激光共聚焦观察HTPP-MDC在细胞中的定位

近年抗菌肽的抗病毒研究逐渐成为热点，抗菌肽的抗病毒机制涉及抑制病毒DNA复制，阻断病毒黏附侵入，以及刺激机体免疫反应等［9-11］。天蚕素类抗菌肽是其中研究历史最长，也是研究最多的一类抗菌肽，具有杀菌、抗病毒、抗癌和免疫调节等多种功能。MDC是本实验室从家蝇中克隆的一种昆虫抗菌肽(GenBank登录号为EF175878)，我们课题组前期研究显示其不仅对多种细菌的标准菌株［12］和临床耐药菌［13］均具有显著的抗菌活性，还能抑制肝癌细胞的增殖，促进机体的免疫调节功能，但对人正常肝细胞和红细胞无毒［14］。更有意义的是 MDC对HepG2．2．15细胞的HBsAg表达具有抑制作用，并呈现一定的浓度依赖关系。这些研究提示MDC对肝脏疾病的临床治疗具有良好的应用前景。因此本课题组提出将MDC与HTPP进行融合的设想。本研究证实设计的HTPP-MDC具有明确的体外抗HBV活性，同时激光共聚焦观察也证实HTPP-MDC能够有效穿透肝细胞膜，快速进入肝细胞内部，表明之前的设计是成功的。目前抗菌肽抗病毒机制研究相关报道不多，根据有限的文献［9-11］我们对HTPP-MDC抑制HBV复制的机制进行大胆推测，认为其可能涉及直接破坏病毒包膜、与病毒糖蛋白相互作用及免疫调节作用等，当然具体的抗病毒机制还有待于进一步的实验验证。

穿膜肽作为药物运输工具，目前研究所发现的大多数缺乏细胞特异性且定位不精确，限制了它的进一步发展［15］。近年研究发现的 HTPP，来源于恶性疟原虫环子孢子蛋白，在其序列中不仅含有1个PELEX/VTS(Plasmodium export element/vacuolar transport signal)基序，能够有效穿透肝细胞膜，介导环子孢子蛋白进入肝细胞内部，实现细胞亚定位［3-4］，同时还具有肝素结合域，能够特异性靶向肝脏［2］，因此HTPP将成为备受青睐的肝细胞靶向穿膜肽。

HTPP-MDC作为小分子多肽类药物，具有作用明确、毒性低、同时兼有靶向肝细胞内抗HBV和免疫调节多重作用，在开发新型抗HBV药物中具有广阔的开发利用价值及市场应用前景，但HTPP-MDC的体内外抗病毒作用及其作用机制还需进行深入研究。