血管紧张素Ⅱ2型受体阻滞剂对小鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响*

李升红， 万 婷， 刘宏伟△， 程 飚， 肖丽玲， 谢光辉， 卢金强， 肖 静

(1暨南大学附属第一医院整形外科，再生医学教育部重点实验室，广东广州510632;2广州市妇女儿童医疗中心妇产科，广东广州510623;3广州军区广州总医院整形外科，广东广州510110)

血管紧张素Ⅱ(angiotensin II，Ang II)是肾素血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)最重要的活性产物，在应激情况下调控血压和水电解质平衡，而且在创伤修复中发挥重要作用［1-4］。Ang II 1型受体(angiotensin II type 1 receptor，AT1受体)介导了Ang II的大部分病理生理作用，大量的研究资料证实AngII与其AT1受体结合后具有促进创面内细胞增殖、分化、迁移及促进创面内细胞因子表达的作用［5-8］。近来有研究证实AT1受体阻断剂具有抑制创面内上皮化、肉芽组织形成和抑制创面内局部生长因子的产生，延缓创面愈合的作用［9-10］。

然而Ang II及其2型受体(AT2受体)在创面如何发挥作用尚不清楚。为进一步阐明AT2受体在Ang II调控创面修复中的作用及其机制，我们通过建立小鼠背部全层皮肤缺损创面模型，观察阻断AT2受体后对创面愈合过程及其对创面局部生长因子表达的影响，探讨AngⅡ和AT2受体调控皮肤损伤修复的作用及其可能的机制。

材料和方法

1 材料

小鼠表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)定量酶联检测试剂盒购自RB。HE染色试剂购自广州化学试剂公司。

2 动物分组及方法

2.1 小鼠创面模型的建立 健康SPF级近交系雄性C57BL/6J小鼠42只，8～10周龄，体重25～30 g，由南方医科大学动物实验中心提供(许可证号为SCXK粤2006-0015)。采用随机数字表法根据检测需要随机分成对照组和PD123319处理组，每个时点3只小鼠，每实验组21只小鼠。在小鼠背部距离中线5 mm两侧各制作1个直径为6 mm的圆形全层皮肤缺损创面。创面形成后，对照组小鼠每天腹腔注射生理盐水0.1 mL，PD123319处理组小鼠每天腹腔注射浓度为1.25 g/L的PD123319溶液0.1 mL(1.25 mg PD123319溶于1 mL生理盐水，每天10 mg/kg)［11-13］。创面形成后第 3、5、7、9、11、13、15 天切取包括2 mm正常组织的创面组织标本，每个标本均分为2份，分别用液氮保存及10%中性甲醛固定。

2.2 创面愈合率的计算 小鼠处死前，以0.08 mL 10%水合氯醛麻醉小鼠，创面附近加标准比例尺，在距离创面10 cm的上方用数码相机(Sony，1 010万像素)拍照。以ImageJ图像分析软件结合标准比例尺分别计算出各实验组小鼠各时点创面面积占原始面积大小，作为各时点创面愈合的百分率。计算公式如下:创面愈合率(%)=(1-各时点创面面积/原始创面面积)×100%。

2.3 创面愈合过程中上皮爬行距离的计算 10%甲醛固定标本，石蜡包埋切片，HE染色，染色切片在Leica核型分析显微镜5 010倍下观察创面愈合过程中上皮爬行距离并拍照，按比例尺计算创面上皮爬行距离(mm)。

2.4 创面内肉芽组织面积计算 10%甲醛固定标本，石蜡包埋切片，HE染色，显微镜下观察肉芽组织形成情况，连续采集50倍照片并拼图。以ImageJ图像分析软件结合标准尺分别计算出各实验组小鼠各时点肉芽组织的面积(mm2)。

2.5 创面EGF、VEGF和bFGF含量的测定 采用双抗体夹心ABC-ELISA法，将保存在液氮中的新鲜组织标本各取0.2 g，电动匀浆机研磨，4℃、15 000 r/min离心30 min(离心半径为6 cm)，取上清与PBS液溶解测定EGF、VEGF和bFGF的蛋白浓度。用抗鼠EGF、VEGF和bFGF单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的鼠EGF、VEGF和bFGF与单抗结合，加入生物素化的抗鼠EGF、VEGF和bFGF抗体，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入酶底物OPD，出现黄色，加入硫酸终止液，在450 nm处测吸光度(A)值，每个样本重复3次，小鼠EGF、VEGF和bFGF浓度与A值呈正比，通过绘制标准曲线求出各时点小鼠创面标本中EGF、VEGF和bFGF的浓度，将上述求出的浓度计算时乘以总稀释倍数(样本稀释倍数)，再除以0.2 g/1.5 mL(样品量与生长因子提取液之比)。

3 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示，应用SPSS13.0统计软件分析，组间数据用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 PD123319对创面愈合率的影响

对照组小鼠背部直径6 mm全层皮肤缺损创面在伤后第3天面积缩小至(30.62±4.96)%，在伤后第5天愈合率明显加快，愈合率约为(63.55±2.57)%，第7天愈合率为(80.78±4.65)%，第9天愈合率为(93.19±6.72)%。PD123319处理组小鼠创面在伤后第3天面积缩小至(32.88±5.17)%，在伤后第5天、第7天与对照组差别较大，愈合率分别为(79.89±4.56)%和(88.98±3.83)%，第9天的愈合率为 (95.68±3.65)%，见图1。

Figure 1.Effect of PD123319 on the rates of wound healing.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group.图1 PD123319对创面愈合率的影响

2 PD123319对创面愈合过程中上皮爬行距离的影响

上皮化是创面愈合的重要标志。在创面形成后第3天出现明显的上皮爬行现象。在伤后第3天对照组上皮爬行距离为(0.25±0.08)mm，PD123319处理组上皮爬行距离为(0.27±0.11)mm，在伤后第5天对照组的上皮爬行距离为(1.22±0.15)mm，PD123319处理组在创面形成第5天上皮爬行距离为(1.65±0.12)mm。在伤后第7天对照组上皮爬行距离为(1.93±0.17)mm，PD123319处理组上皮爬行距离为(2.36±0.18)mm，见图2。

3 PD123319对创面内肉芽组织形成的影响

创面内肉芽组织是由新生的成纤维细胞和毛细血管组成，对创面愈合起着重要的作用。小鼠背部6 mm圆形创面在第3天后形成肉芽组织，对照组第3天肉芽组织面积为(11.96±1.12)mm2，第5天面积为(9.37±0.53)mm2，第7天面积为(7.15±0.42)mm2;PD123319处理组第3天面积为(12.17±1.73)mm2，第5天面积为(11.51±0.98)mm2，第 7天面积为(9.32±0.67)mm2，PD123319处理组小鼠肉芽组织面积明显低于对照组小鼠，见图3。

4 PD123319对创面愈合过程中 EGF、VEGF和bFGF产生的影响

因PD123319对创面愈合过程中创面愈合率、肉芽组织形成和上皮爬行距离的影响在伤后第5和7天表现出最为明显的效应，因而于创面形成后第5和7天检测创面新鲜肉芽组织中EGF、VEGF和bFGF表达量的变化，结果发现PD123319组小鼠创面肉芽组织中的生长因子表达量明显高于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见图4。

Figure 2.Effect of PD123319 on migration distance of the epithelium(HE staining，×50).Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group.图2 PD123319对创面愈合过程中上皮化的影响

Figure 3.Effect of PD123319 on granulation tissue area(HE staining，×50).Mean±SD.n=6.*P ＜0.05 vs control group.图3 PD123319对创面内肉芽组织形成的影响

讨 论

AngⅡ是RAS最重要的生物活性肽，除经典作用外还作为一个多效应生长因子可影响细胞的增殖、凋亡和分化，参与皮肤组织的胚胎发育、自我更新和损伤修复［3］。目前已经明确的血管紧张素受体主要是AT1和AT2受体［14］。血管紧张素受体阻滞剂是新一类抗高血压药物，其作用机制为竞争性拮抗AT1或AT2受体，能够完全阻断Ang II通过AT1或AT2发挥其生理作用。目前普遍认为AngⅡ主要的病理生理学作用由AT1受体介导［6］，其与 AngⅡ结合在外周组织可以刺激生长因子合成，促进细胞增生、迁移及促进创面细胞因子的表达，诱导血管生成。AT2受体的作用可能与AT1受体相反，在机体内环境中，AT2受体激活后可发挥抑制增殖、舒张血管、促进凋亡等作用［15］。Munk 等［16］发现在小鼠缺血心肌模型中AngⅡ通过AT2受体可以诱导血管形成。Waseda等［17］在小鼠肺纤维化动物模型中发现AngⅡ与AT2受体结合可以减轻博来霉素导致的纤维化。Izu等［18］发现 AT2阻滞剂能够促进骨质形成。吴姮君等［4］发现在小鼠皮肤组织中有AT2受体的表达，AT2受体在创面形成后逐渐升高，在创面愈合后即开始下降，当创面愈合后再次逐渐升高，AT2受体可能与创面内细胞凋亡及其创面愈合后的重建塑型有关。

然而AT2受体在皮肤创伤愈合过程中的作用却知之甚少。为探明AngⅡ及其AT2受体在创面愈合过程中的作用，我们通过给予AT2受体特异性阻断剂PD123319，观察其对创面愈合的影响。在本实验中我们观察到PD123319加快了小鼠创面愈合的速度，创面内上皮爬行和肉芽组织形成都表现出明显加快的现象。因此推测AT2受体阻滞剂能够促进创面内上皮细胞迁移和肉芽组织形成，具有促进创伤愈合的作用。

此外，使用AT2受体特异性阻断剂后，在创面形成后第5天和第7天创面组织内EGF、VEGF和bFGF的含量明显高于对照组小鼠。因此推测AT2受体阻断剂促进创面上皮化和肉芽组织形成可能与促进创面局部生长因子的表达有关。

综上所述，阻滞AT2受体可以促进创面上皮细胞迁移和肉芽组织形成，其促进创面愈合的作用可能与其促进创面内EGF、VEGF和bFGF等生长因子的表达有关。本研究结果将有可能为难愈创面和瘢痕的治疗提供新的思路和方法。