血清miR-21在糖尿病肾病中的诊断价值*

朱柄铭， 陈文璟， 苏运钦， 温旺荣

(暨南大学附属第一医院临床医学检验中心，广东广州510632)

糖尿病肾病是糖尿病重要的微血管病变之一，终末期患者5年存活率仅为20%［1］，是I型糖尿病患者的主要死因;在II型糖尿病中其严重性仅次于心、脑血管疾病［2］。由于其呈渐进式缓慢发展，起病隐匿，加之当今诊断手段的局限性，不易早期诊断及治疗，一旦确诊，整个病程将无法逆转。这就需要我们发现能早期对其进行诊断的标志物。研究证明microRNAs(miRNAs)在糖尿病及其并发症中发挥重要作用，但研究都局限于动物模型或者组织细胞，也有对血浆研究的报道，而缺乏对血清中相关miRNAs表达的研究。miRNAs能游离于细胞，稳定存在于血清中，且血清miRNAs检测具有创伤小、灵敏度和特异性高的特点［3-4］，这就为糖尿病肾病的分子诊断，尤其对早期临床症状、体征不明显的患者提供了早期诊断与预测的可能。

材料和方法

1 实验对象

2012/04～2013/05暨南大学附属第一医院收治的门诊、住院病人以及健康体检者125例，其中符合WHO糖尿病专家委员会提出的糖尿病诊断标准且尿微量白蛋白(urinary microalbumin，UmAlb)在正常参考范围 (＜14.29 mg/L)的25例II型糖尿病患者为糖尿病A(diabetes mellitus A，DMA)组，平均年龄(58.28±9.02)岁，男13例，女12例;符合II型糖尿病诊断，且UmAlb超出正常参考范围(＞14.29 mg/L)，同时其肾脏检验学及影像学检测指标均无异常的25例患者为糖尿病B(diabetes mellitus B，DMB)组，平均年龄(59.64±10.19)岁，男15例，女10例;经肾脏检验学、影像学以及病理学活检确诊的25例糖尿病肾病患者为糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)组，平均年龄(60.28±8.89)岁，男16例，女9例;由糖尿病肾病引发且符合美国肾脏病基金会K/DOQI专家组对慢性肾脏疾病(chronic kidney disease，CKD)分期建议中的CKD5期，且出现尿毒症症状的25例患者为尿毒症(uraemia，UM)组，平均年龄(61.84±9.56)岁，男12例，女13例;25例性别、年龄相匹配的健康体检者设为正常对照(normal control，NC)组，平均年龄(57.00 ±9.36)岁，男14 例，女11例，其肾脏检验学和影像学检测指标均未见异常且无任何糖尿病病史。

2 主要试剂及仪器

TRNzol-A+和RNase-Free ddH2O购自北京Tiangen;氯仿、异丙醇和无水乙醇购自广州达晖生物技术有限公司;逆转录5×Buffer和dNTP购自Invitrogen;MMLV逆转录酶购自中山大学达安基因股份有限公司;血清miRNA实时定量PCR试剂盒HairpinitTMmiRNAs qPCR Quantitation Kit、线虫 miRNA CelmiR-39的双链mimics及Hsa-miR-21和Cel-miR-39逆转录引物购自上海GenePharm;中国科技大学中佳公司KDC-160HR高速冷冻离心机;ESCO生物安全柜 (II级B2型);Eppendorf公司生产的Biophotomet生物分光光度计及加样枪;Applied Biosystems公司生产的ABI7000型定量PCR仪。

3 方法

3．1 血清制备 用真空无抗凝管抽取实验对象3～4 mL外周静脉血，常温下待血液凝固，1 h内进行处理。血标本在3 500 r/min下离心10 min，转移上层血清至1.5 mL Eppendorf管，－70℃保存备用。

3．2 总RNA抽提 冷藏血清样本置冰上融化后，充分混匀，吸取200μL加入3倍体积TRNzol-A+中，于振荡器上充分混匀，匀浆在室温静置5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。为控制提取过程中样本间的差异，在静置结束后，向每份匀浆样本中加入人工合成的20μmol/L线虫Cel-mirR-39 mimics 4μL作为外源性内参照，充分混匀，用于提取、逆转录及后续定量检测全过程。4℃、12 000 r/min离心10 min，取上清。加入120 mL氯仿，剧烈漩涡混匀15 s，室温静置3 min。4℃、12 000 r/min离心12 min。将离心得到的水相(约400μL)转移至新的 Eppendorf管中，再加入等体积异丙醇，混匀，室温静置25 min。4℃、12 000 r/min离心 10 min，去上清。用 RNase-Free ddH2O与无水乙醇配制的1 mL 75%乙醇洗涤沉淀，4℃、5 000 r/min离心3 min。吸净上清，室温晾干约2～3 min，加入30μL RNase-Free ddH2O，吹打混匀，充分溶解 RNA。A260/A280为 1.8～2.1，取RNA浓度为25～50 ng/L进一步实验。

3．3 引物设计与合成 miRBASE数据库(http://www．Mirbase．org/)提供有成熟的 Has-miR-21 和Cel-miR-39序列，见表1，由上海GenePharm公司根据表1中的序列设计特异性茎环结构(stem-loop)逆转录引物、PCR扩增引物以及 Cel-miR-39双链mimics，见表 2。

表1 Has-miR-21和Cel-miR-39双链mimics的序列Table 1．Sequences for Has-miR-21 and Cel-miR-39 double-stranded mimics

表2 用于扩增Has-miR-21和Cel-miR-39的实时荧光定量PCR引物Table 2．Real-time fluorescence quantitative PCR primers for amplification of miR-21and Cel-miR-39

3．4 逆转录反应 20μL体系包括5×buffer 4μL，dNTP(10 mmol/L)0.75μL，逆转录引物(1 mol/μL)1.20μL，MMLV 逆转录酶(2 ×108U/L)0.2 μL，总RNA样本5μL，剩余体积用 RNase-Free ddH2O补足。反应设1个复孔，反应条件:16℃ 30 min，42℃ 30 min，85 ℃ 5 min。

3．5 实时荧光定量PCR 20μL体系包括2×real time PCR buffer 10 μL(内含 3 mmol/L Mg2+，0.2 mmol/L dNTP和SYBR Green I荧光染料)，正、反向特异引物套装(5 mol/μL)0.32μL，Taq DNA聚合酶(5×106U/L)0.2 μL，cDNA 模板2 μL，剩余体积用RNase-Free ddH2O补足。反应设1个复孔，反应条件:95℃ 3 min;95℃12 s，62℃ 50 s，40个循环。

3．6 血清miR-21表达量 相对表达量用2－ΔΔCt表示，－ΔΔCt= －［(标本 Cttarget－标本 CtCel-miR-39)－(对照Cttarget－对照 CtCel-miR-39)］，以正常对照组中miR-21的Ct值为对照。

3．7 ROC(receiver operating characteristic)曲线 使用SPSS13.0统计软件以敏感性为纵坐标，(1－特异性)为横坐标作图，绘制ROC曲线。通过ROC曲线下面积(area under the curve，AUC)大小判断血清miR-21的诊断效果，其面积一般在0.5～1.0之间。AUC≤0.7时表示诊断价值较低;0.7＜AUC≤0.9时表示诊断价值中等;AUC＞0.9时表示诊断价值较高;AUC接近0.5时，即ROC曲线接近对角线，则诊断试验失去临床意义。

4 统计学处理

利用SPSS 13.0统计软件进行数据处理。相对表达量成偏态分布且方差不齐，将2－ΔΔCt进行对数转换，经K-S检验和Levene检验，数据呈正态分布且具方差齐性(均P＞0.05)。利用单因素方差分析(Oneway ANOVA检验)进行统计分析，多变量间两两比较采用LSD-t检验。选用Pearson和Spearman相关分析检测血清miR-21表达水平与其它临床指标的关系。根据血清中miR-21的相对表达量建立logistic回归模型，绘制ROC曲线评价血清miR-21的诊断效能。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 熔解曲线和扩增产物验证

miR-21熔解曲线约在(77.5±0.7)℃ 呈现单峰;Cel-miR-39熔解曲线约在(82.4±0.6)℃呈现单峰，且均无引物二聚体与其它非特异杂峰存在，阳性反应的峰可与阴性、空白对照明显区分开，表明PCR反应参数合适，扩增目标产物特异性较好。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证，可见80 bp左右单一条带，见图1。

Figure 1．Serum miR-21 PCR product electrophoresis for each group．1:20 bp marker;2:normal control;3:diabetes mellitus A patients;4:diabetes mellitus B patients;5:diabetic nephropathy patients;6:uremia patients;7:negative control．图1 各组血清中miR-21扩增产物电泳图

2 定量PCR检测结果

各组血清样本中miR-21及Cel-miR-39的扩增反应曲线呈标准S型，阴性对照产生微弱非特异信号呈不规则曲线，空白对照无扩增曲线，见图2。

Figure 2．The amplification curves of real-time fluorescence quantitative PCR for serum miR-21 and exogenous internal reference CelmiR-39 in each group．A～E:Cel-miR-39 curves;F:miR-21 curve of diabetes mellitus A patients;G:miR-21 curve of normal control;H:miR-21 curve of diabetes mellitus B patients;I:miR-21 curve of diabetic nephropathy;J:miR-21 curve of uraemia;K:miR-21 curve of negative control;L:Cel-miR-39 curve of negative control;M:miR-21 curve of blank control;N:Cel-miR-39 curve of blank control．图2 各组血清中miR-21及外源性内参Cel-miR-39的实时荧光定量PCR扩增曲线

3 各组血清中miR-21的表达水平

经单因素方差分析，比较5组间的相对表达量有统计学意义(F=81.92，P＜0.01)，进一步使用LSD-t检验做两两比较，正常对照组血清miRNAs水平显著低于糖尿病A组，显著高于其它3组(4组均P＜0.01);糖尿病A组的血清miRNAs水平显著高于糖尿病B组、糖尿病肾病组以及尿毒症组(3组均P＜0.01);糖尿病肾病组血清miRNAs水平显著高于尿毒症组，显著低于糖尿病B组(2组均P＜0.01)，见图3。

4 血清miR-21水平与糖尿病肾病组患者临床指标的关系

血清miR-21水平与糖尿病肾病组患者年龄、性别、血清肌酐(serum creatinine，SCr)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin A1c，HbA1c)、尿蛋白 (urinary microprotein，UMTP)以及尿肌酐(urinary creatinine，UCr)无相关性，但与胱抑素 C(cystatin C，CysC)、UmAlb、Um-Alb/UCr比值呈显著负相关(P＜0.01，P＜0.05，P ＜0.05)，见表3。

Figure 3．The serum miR-21 expression level in each group．NC:normal control;DMA:diabetes mellitus A patients;DMB:diabetes mellitus B patients;DN:diabetic nephropathy patients;NM:uremia patients．n=25．＊＊P ＜0.01 vs NC;##P ＜ 0．01 vs DMA;△△P ＜0．01 vs DN．图3 各组血清中miR-21表达量

5 血清miR-21的诊断价值

5．1 ROC曲线下面积 根据建立的Logistic回归模型计算血清miR-21的ROC曲线下面积，在DN组+NC组、DN组+DMA组、DN组+DMB组、DN组 +DMA组 +NC组、DN组 +DMB组 +NC组、DN组+DMA组+DMB组、DN组+DMA组+DMB组+NC组，7组人群中诊断糖尿病肾病的AUC分别为0.848(95%CI:0.737～0.959)、0.896(95%CI:0.812～0.980)、0.782(95%CI:0.641 ～0.922)、0.838(95%CI:0.743 ～0.933)、0.796(95%CI:0.675～0.917)、0.808(95%CI:0.704 ～0.911)和0.845(95%CI:0.752～0.939)，见图4。

表3 血清miR-21水平与糖尿病肾病患者临床指标的关系Table 3．The association between miR-21 level and clinical parameters in patients with diabetic nephropathy(Mean±SD)

Figure 4．The ROC curves of serum miR-21 in different groups for the diagnosis of diabetic nephropathy．图4 不同组群血清中miR-21诊断糖尿病肾病的ROC曲线

5．2 诊断效能 根据不同组群血清中miR-21的相对表达量建立的logistic回归模型，血清miR-21在鉴别DN组与NC组、DMA组、DMB组的敏感性和特异性分别为 80．0%和 72．0%、72．0%和 88．0%、72．0%和 84．0%，准确性分别为 76.0%、80.0%和78.0%;在鉴别DN组与DMA组+NC组、DMB组+NC组、DMA组+DMB组的敏感性和特异性分别为76．0% 和 77．0%、76．0% 和 82．0%、70．0% 和86．0%，准确性分别为 76．5%、79.0% 和 78.0%;在DN组+DMA组+DMB组+NC组中诊断糖尿病肾病的的敏感性和特异性分别为76．0%和77．3%，准确性为76．7%。各组群的Youden指数(Youden index，YI)介于0～1之间，表明诊断试验真实性较好，见表4。

讨 论

miRNAs是一类长约22个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA，通过转录后产物对mRNA的调节参与到基因表达的调控［5］，Calin等［6］研究发现，定位于肿瘤相关基因组区域的miRNA达50%以上，可能具有原癌或抑癌基因的功能，与肿瘤的发生密切相关。越来越多的研究发现miRNAs表达异常也参与糖尿病及其并发症等疾病的发生发展［7-11］。具有癌基因特征的miR-21已在多种肿瘤疾病中得以深入研究，最近在糖尿病肾病研究领域也开始引发关注［12-14］，但目前研究多集中于miR-21在糖尿病肾病动物模型或组织细胞中的调控机制与表达特点，本文首次涉及到血清miR-21的表达研究。虽然曾健英等［15］报道3种血清微小RNA检测在糖尿病肾病中的作用，但其全血中添加了依地酸二钠(EDTA-Na2)进行抗凝，实验样本已不是血清而是血浆。

表4 血清miR-21对不同组群中糖尿病肾病的诊断效能Table 4．Serum miR-21 diagnostic efficacy for diabetic nephropathy in different groups(%)

本研究用于检测血清miR-21表达量的实时荧光定量PCR，需要利用合适的内参来消除RNA提取时样品间的差异，因此，内参的稳定性决定着检测结果的准确性。目前多数研究选用的内参都源自血清本身所含有的miRNAs、snRNA及管家基因等经典内参［17］，而这些内参在血清中的来源尚不明了，含量也远不及组织细胞，甚至在不同的疾病状态下表达量还可发生变化［16］，给这些内参在血清中的表达带来了不确定性。人工合成的外源性miRNAs由于人体内不曾有该种序列且不受体内复杂环境的影响，以此作为内参则能很好地解决上述缺陷。因此，本研究选用合成的外源性内参Cel-miR-39［17-18］。

本研究发现，miR-21在糖尿病肾病患者血清中的表达量显著低于正常人以及糖尿病A、B组患者(3组均P＜0．01)，但却显著高于有尿毒症症状的患者(P＜0．01)，血清miR-21的这一变化趋势与Zhang等［19］在早期糖尿病肾病小鼠肾小球系膜细胞中的研究结果一致。血清miR-21的低表达与CysC、UmAlb、UmAlb/UCr比值有显著负相关性，而与年龄、性别、SCr、BUN、FBG、HbA1c、UMTP 以及UCr没有相关性，其中与UmAlb具有显著负相关进一步支持了Zhang等认为miR-21高表达可降低尿蛋白排泄率、是糖尿病肾病保护因素的观点。Logistic回归及ROC曲线分析表明血清miR-21在糖尿病肾病和正常组，糖尿病肾病和糖尿病A组，糖尿病肾病和糖尿病B组，糖尿病肾病和糖尿病A组及正常组，糖尿病肾病和糖尿病B组及正常组，糖尿病肾病和糖尿病A组及糖尿病B组，糖尿病肾病和糖尿病A组、糖尿病B组及正常组等7组人群中诊断糖尿病肾病具有较好的实用价值，且在7组人群中诊断糖尿病肾病的ROC-AUC、敏感性和特异性都较为理想，说明miR-21或可作为糖尿病肾病的潜在分子诊断指标。另外值得注意的是，我们首次发现血清miR-21在糖尿病A组中较正常组显著升高(P＜0.01)，一旦患者UmAlb超出正常，血清 miR-21的表达则开始迅速下降，随着病情发展直到尿毒症症状出现，血清miR-21一直趋于降低。与此类似，Szeto等［20］认为糖尿病肾病引起的CKD患者尿沉渣中miR-21表达量与肾小球滤过率呈正相关，尿沉渣中有高含量miR-21的患者血透生存期较长，证明高表达的miR-21或许是糖尿病肾病的保护因素，同时还提示miR-21或可在糖尿病患者中预测糖尿病肾病的发生，对糖尿病肾病的早期诊断具有一定的提示作用，还可作为评估糖尿病肾病患者病情的一项潜在分子指标。

就目前糖尿病肾病的诊断与治疗现状而言，如何提高糖尿病肾病早期诊断水平仍然是一个极具挑战性的问题。近来的研究认为在糖尿病肾病模型的肾脏组织、细胞中具有特异miRNAs表达谱的变化特征，虽然组织细胞中的miRNAs表达谱可能与糖尿病肾病的发生、发展及预后相关，但检测手段繁杂、极具创伤性，不便于临床诊断的开展。较之而言，外周循环中的血清有着应用简便，创伤微小，利于推广等优势。而且血清中miRNAs能经受RNA酶降解，在煮沸、酸碱、反复冻融、长期保存等严酷环境下仍可稳定存在［21］。本研究采用SYBR Green I荧光定量 PCR检测血清miR-21，操作快速、简单，且成本低廉，仅需200μL血清即可完成定量测定。我们的研究结果，提示了血清miR-21可能在糖尿病肾病诊断中起到重要作用，至于何种机制有待进一步研究。有理由相信，随着miRNAs在糖尿病肾病研究领域的广泛深入，血清miRNAs应用于诊断糖尿病肾病可提高对其的诊治水平，改善预后。