HPLC法测定兽用白头翁颗粒中白头翁皂苷B4含量*

张 颖，韦旭斌，沈志强

(1.吉林大学 畜牧兽医学院，吉林 长春 130062； 2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600)

白头翁颗粒是以传统方剂“白头翁汤”为基础，结合现代制剂技术制备出的一种新型制剂。由白头翁、黄连、黄柏、秦皮4味药组成，具有清热解毒、凉血止痢之功效，主治湿热泄泻，下痢脓血[1]。现代药理研究发现，白头翁汤及其主要成分具有抗菌[2-3]、抗炎、抗腹泻[4]、抗细菌内毒素[5]、抗肿瘤[6]及促进免疫调节[7]等作用。在兽医临床上主要用于热痢、腹痛、里急后重等症的治疗。方中白头翁为君药，白头翁皂苷B4为白头翁中主要有效成分[8]，其含量测定方法主要有RT-HPLC法[9]、HPLC-ELSD联用[10]和薄层扫描法[11]以及运用HPLC指纹图谱法提供了白头翁汤颗粒剂的特征性图谱[12]，但对白头翁汤制剂中白头翁皂苷B4的含量测定未见报道。本文旨在采用HPLC法测定白头翁颗粒中白头翁皂苷B4的含量，为该制剂的质量研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪 器

Agilent 1260 高效液相色谱仪(G1329A自动进样器，UV检测器)，BS110型电子天平(北京赛多利斯)、SB3200超声波清洗器(上海宁波新芝生物技术研究所)。

1.2 药品与试剂

白头翁颗粒(中试样品，山东绿都安特动物药业有限公司提供，批号：20120913、20121015、20121224)；纯化水(山东绿都安特动物药业有限公司)；白头翁皂苷B4对照品(中国药品生物制品检定所，批号：111766-20601)。

甲醇(色谱纯，山东欧化化工有限公司)、乙腈(色谱纯，山东欧化化工有限公司)、磷酸(分析纯，山东禹王实业有限公司)、乙醇(分析纯，山东禹王实业有限公司)。

1.3 色谱条件

色谱柱：HypersilC18(250 mm×4.6 mm,5 μL)；流动相：乙腈-0.1%磷酸(27：73，V/V)；流速1.0 mL/min ，柱温30 ℃；检测波长205 nm，进样量20 μL；理论板数不低于3000(按白头翁皂苷B4计)。

1.4 溶液的制备

1.4.1 对照品溶液 精密称取白头翁皂苷B410.0 mg，置于5 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得对照品溶液，浓度2.0 mg/mL，备用。

1.4.2 供试品溶液 称取白头翁颗粒粉末1 g，加70%乙醇20 mL，超声处理15 min，待冷却后过滤，取滤液水浴挥干，放冷，加流动相适量将其溶解，置10 mL量瓶中，稀释定容，作为供试品溶液，备用。

1.4.3 阴性对照溶液 称取未加白头翁药材制备的白头翁颗粒粉末1 g，加70%乙醇20 mL，超声处理15 min，待冷却后过滤，取滤液水浴挥干，放冷，加流动相适量将其溶解，置于10 mL量瓶中，稀释定容，即得缺白头翁的阴性对照溶液，备用。

1.5 系统适用性试验

分别吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各20 μL，注入液相色谱仪，按“1.3”项下色谱条件测定，记录白头翁皂苷B4色谱图。

1.6 线性关系考察

精密称取白头翁皂苷B4对照品15 mg，置5 mL量瓶，流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液。精密量取储备液适量，用流动相倍比稀释成质量浓度分别为0.1、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 mg/mL的标准系列溶液，分别进样20 μL，记录色谱图。以白头翁皂苷B4的质量浓度(X)为横坐标，色谱峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线并作回归分析。

1.7 加样回收率试验

精密称定已知含量的白头翁颗粒样品9份(批号：20121224)，按“1.4.2”项下处理，制成样品溶液，精密称取白头翁皂苷B4对照品分别加入样品溶液中，制成高、中、低不同浓度的加标样品溶液9份，备用。按上述色谱条件，取加标样品溶液各20 μL进样，记录色谱图并计算回收率。

1.8 重复性试验

1.8.1 仪器精密度 在上述色谱条件下，取2.0 mg/mL的白头翁皂苷B4对照品溶液，连续进样5次，每次进样20 μL，记录色谱图剂及白头翁皂苷B4色谱峰面积。

1.8.2 重现性 取同一批样品6份，每份精密称取1.0 g(批号：20121224),按“1.4.2”项下方法制备供试品溶液，在上述相同色谱条件下，分别进样20 μL，记录并比较供试品溶液中白头翁皂苷B4的峰面积值。

1.9 稳定性试验

将“1.8.2”项下的供试品溶液于室温条件下放置，按“1.3”项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8、12、24 h时各进样20 μL，记录图谱并比较供试品溶液中白头翁皂苷B4含量测定值。

1.10 样品含量测定

分别精密称取3个批次(批号：20120913、20121015、20121224)白头翁颗粒样品1 g，依照“1.4.1”项下方法制成供试品溶液，按上述色谱条件，分别进样，记录色谱图，测定供试品溶液中白头翁皂苷B4的含量。

2 结果与分析

2.1 专属性

供试品溶液中白头翁皂苷B4色谱峰保留时间与对照品溶液一致(约18.0 min)且阴性对照色谱图上无色谱峰出现。供试品溶液中白头翁皂苷B4色谱峰与相邻色谱峰的分离度R>1.5；拖尾因子处于0.95～1.05之间，结果见图1。

A 对照品溶液 Reference solution B 供试品溶液Test solution图1 白头翁皂苷B4 色谱图Fig.1 Chromatogram of Pulchinenoside B4

2.2 线性关系

以白头翁皂苷B4质量浓度(X)为横坐标，色谱峰面积(Y)为纵坐标所做标准曲线见图2。对标准曲线进行线性回归，回归方程为：Y=4016x+71.36(r=0.9995, n=6)。结果表明，白头翁皂苷B4在质量浓度0.1～2.0 mg/mL范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.3 加样回收率

按外标法以白头翁皂苷B4含量计算回收率，结果见表1。样品中白头翁皂苷B4的平均回收率为99.28%(RSD =2.09%，n=9),说明该方法回收率高，准确度好。

2.4 重复性试验

仪器精密度试验结果显示，白头翁皂苷B4峰面积的RSD值为1.33%(n=5)，表明仪器精密度好。重现性试验结果见表2。测得6份样品中白头翁皂苷B4含量的RSD值为1.06%(n=6)，说明该方法重现性良好。

图2 白头翁皂苷B4标准曲线Fig.2 The standard curve of Pulchinenoside B4

2.5 稳定性试验

相同色谱条件下，不同时间段(0、1、3、6、12、24 h)测得同一白头翁皂苷B4对照品溶液色谱峰面积的RSD值为0.46%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内白头翁皂苷B4含量较稳定，同时也说明该试验方法稳定性较好。

2.6 样品含量测定

在相同试验条件下，样品中白头翁皂苷B4的平均含量为11.29mg/g(RSD =0.77%，n=9)，测定结果见表3。试验数据显示，不同批次样品中测得白头翁皂苷B4的含量差异不显著，约为11 mg/g。

表1 样品加样回收率试验结果(n=6)Table 1 The results of sample recovery test

表2 重现性试验结果(n=6)Table 2 The results of repeatability test

表3 样品含量测定结果(n=9)Table 3 The results of content sample test

3 讨 论

白头翁颗粒中化学成分复杂，检测易受干扰。试验中曾对3个流动相体系(甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸)进行了比较，并参照白头翁汤颗粒的指纹图谱[12]，综合考察峰形、分离度、拖尾因子、保留时间等因素，以流动相乙腈-0.1%磷酸(27：73，V/V)为最佳。

据文献报道[9-10,13]，制剂中白头翁皂苷B4的含量测定方法主要为：紫外高效液相色谱法(HPLC-UV)和蒸发光散射高效液相色谱法(HPLC-ELSD)。ELSD检测器虽是通用型检测器但使用范围小，而紫外检测器(UVD)的应用具有广泛性，在200～400 nm范围内有紫外吸收的物质均可考虑使用。与HPLC-ELSD法相比，本试验所采用HPLC-UV操作更简单、方便。同时，本试验所建方法的样品色谱图中白头翁皂苷B4色谱峰与相邻色谱峰分离度高，且无脱尾现象，与RT-HPLC法[9]比较，其专属性强，结果更准确、重现性最佳，为白头翁颗粒质量控制的标准化和规范化提供了科学依据。

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