牛妊娠相关糖蛋白ELISA对早期妊娠诊断效果的影响

李艳艳，胡建宏，雷 静，曲立立，赵健玲

(1.西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2.宁夏农垦贺兰山奶业有限公司，宁夏 银川 750021；3.新疆阜康市九运街镇兽医站，新疆 阜康 831501)

随着科学技术的不断发展，通过检测牛奶或血液中牛妊娠相关糖蛋白(PAG)浓度的变化，能够用于奶牛的早期妊娠诊断[1]。哺乳动物妊娠时，外周血液中PAG变化可作为母牛是否怀孕的标志。在母牛怀孕时，PAG浓度从妊娠后第15～35 d开始上升，但因血清中不同PAG水平的差异，到妊娠第26～30 d才能将PAG作为可靠的妊娠指标[2]。目前，商业化检测PAG对待检牛影响小，结果判定标准化，适用于规模牛场母牛早期妊娠诊断[1]。

为了分析利用牛妊娠相关糖蛋白检测奶牛早期妊娠诊断的实际效果，于2012年6～8月对宁夏平吉堡奶牛场273头配种后28～45 d的荷斯坦奶牛使用基于PAG的商品化试剂盒(IDEXX牛怀孕检测试剂盒)进行早期孕检，并在人工授精后75 d进行直肠妊娠诊断确认，分析快速PAG酶联免疫法的实际应用效果，以期提高奶牛繁殖效率，并为奶牛场进行母牛的早期妊娠诊断提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选择发情配种后28～45 d的黑白花奶牛273头，采集静脉血液10 mL，送入实验室进行快速PAG酶联免疫法妊娠诊断。

1.2 试剂

牛怀孕检测试剂盒由北京爱德士元亨生物科技有限公司提供。批次41169-X961， 有效期至2013年2月28日。

1.3 牛怀孕检测试剂盒操作步骤及结果判读

将待检血清和牛怀孕检测试剂盒恢复到室温，按照ELISA试剂盒产品说明书要求进行孵育和操作，检测待检牛的妊娠状况，具体结果诠释方法为：血清或EDTA血浆 S-N值<0.300，为阴性，表示母牛空怀；血清或EDTA血浆 S-N值≥0.300，为阳性，表示母牛怀孕。

1.4 母牛直肠检查结果判定

牛怀孕检测试剂盒诊断出的阴性(空怀)牛和阳性(怀孕)牛均不予处理，等待配种后75 d进行直肠妊娠诊断确认。自然返情时直肠触诊有卵泡发育以及75 d直肠触诊未怀孕者确定为空怀牛；75 d直肠妊娠检查怀孕的母牛确定为怀孕牛。

1.5 结果分析

在结果判定中，敏感性为妊娠牛样品中PAG酶联免疫法检测结果为阳性的比例；特异性为空怀牛样品中PAG检测结果为阴性的比例。结果的阳性预测值为PAG检测为已孕的牛确定为真实妊娠的比例，结果的阴性预测值为PAG检测为空怀的牛确定为真实为空怀的比例；结果的准确性为PAG检测的妊娠状况(妊娠+空怀)与直肠触诊结果一致的比例。

1.6 统计分析指标

利用Kappa值对PAG酶联免疫法和直肠触诊妊娠诊断结果进行一致性评价。Kappa值为1表明完全符合，0为完全不符[3]。在比较性试验中，Kappa值在0.4～0.5之间，说明符合率中等；0.5～0.6说明符合率良好；>0.6说明符合率很高。

2 结果与分析

在试验期间，对273头奶牛分别使用牛妊娠相关糖蛋白(PAG)ELISA试剂盒和直肠检查两种方法进行妊娠检测，并将得到的结果进行比对。

利用PAG ELISA试剂盒共检测出80头奶牛阴性(空怀)，193头奶牛阳性(怀孕)。在75 d直肠检查时发现，使用PAG ELISA试剂盒检测为阴性(空怀)的80头牛全部为空怀。因此，使用牛妊娠相关糖蛋白(PAG) ELISA试剂盒检测的阴性预测值为100%(见表1)。

表1 PAG ELISA试剂盒检测出的全部空怀牛检测当日至直肠检查期间的结果(n=80)Table 1 The status of nonpregnant cows with a negative PAG ELISA outcome until detection by rectal palpation(n=80)

*自然返情直检有卵泡发育的牛只判定为空怀。

*Cows diagnosed as nonpregnant based on return to estrus and follicular development by rectal palpation.

PAG ELISA试剂盒检测为阳性(怀孕)的193头牛中，75 d直肠检查时发现其中的167头已孕，而26头为空怀，有返情表现的牛平均返情时间为49.5 d，怀疑这26头牛早期胚胎死亡或者流产。为了分析PAG ELISA试剂盒检测结果的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性，建立了2×2列联表(见表2)，并在表3中列出了以75 d进行直肠触诊为标准，PAG ELISA试剂盒的准确性。

从表3可以得出，PAG ELISA试剂盒妊娠诊断的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为100%、75.5%、86.5%、100%和90.5%，Kappa为79.1%。PAG ELSIA试剂盒和直肠触诊妊娠诊断结果符合率很高。

Kappa(K)值适用于计数资料的一致性评测，由表2数据计算得来。Kappa值范围在+1与-1之间。若Kappa值>0.6，表示一致性相当可靠。

本研究结果表明：

两种妊检方法的一致率

Po=a+d/N=(167+80)/273=90.5%

机遇一致率

Pe=[(a+c)(a+b)/N+(b+d)(c+d)/N]/N

=[(167×193)/273+(106×80)/273]/273=54.6%

非机遇一致率=1-Pe=1-54.6%=45.4%

实际一致率=Po-Pe=90.5%-54.6%

=35.9%

从以上Kappa值可以看出，两种妊娠鉴别方法结果的一致有多大程度由非机遇所带来，也即真正一致的程度。本试验中Kappa为79.1%，表明PAG ELSIA试剂盒和直肠触诊两种妊娠诊断结果符合率很高，应用PAG ELSIA试剂盒完全能够用于奶牛早期妊娠诊断。

3 讨 论

IDEXX牛怀孕检测试剂盒是根据酶联免疫反应原理设计的、用于检测怀孕早期存在于牛血清或EDTA血浆中的怀孕相关蛋白(PAGs)，此类蛋白可以作为牛怀孕的标志。微孔板已经包被有怀孕相关蛋白抗体，将待检样品进行稀释并孵育后，捕获到的怀孕相关蛋白(PAG)可以与特异性的PAG抗体(检测溶液)和辣根过氧化物酶标记物(酶标抗体)结合。未被结合的酶标抗体则被洗掉，随后在孔内加入TMB底物溶液。孔内溶液的颜色深浅与样品中PAG的含量成比例。最终结果通过酶标仪读取并利用Xchek软件进行阴阳性判读。在本研究中，PAG ELISA试剂盒检测母牛妊娠诊断的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为100%、75.5%、86.5%、100%和90.5%，与直肠检查75 d结果相同，表明该方法可用于母牛的早期妊娠诊断。Silva等[4]评估PAG判断妊娠状况准确性试验中得出，PAG检测方法的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为96.8%～98.9%、91.7%～97.3%、89.7%～93.8%、97.5%～99.5%和93.9%～97.8%，本研究与Silva等[4]的研究一致，说明PAG ELISA试剂盒检测的敏感性和阴性预测值均很高，便于准确发现空怀牛，及时对其进行处理，及早再次配种，缩短配种间隔，达到减少空怀天数的目的。

表2 PAG ELISA试剂盒检测结果的敏感性①、特异性②、阳性预测值③、阴性预测值④和准确性⑤的2×2列联表评估表(n=273)Table 2 Contingency table (2×2) for evaluation of sensitivity①, specificity positive②, positive predictive value③, negative predictive value④, and accuracy⑤ of PAG ELISA test (n=273)

注：① 直肠触诊为妊娠样品中，PAG检测结果为阳性的比例[a/(a+c)]×100 ② 直肠触诊为空怀的样品中，PAG检测结果为阴性的比例[d/(d+b)]×100 ③ PAG检测为已孕的牛只，确定为真实妊娠[a/(a+b)]/×100 ④ PAG检测为空怀的牛只，确定为真实为空怀[d/(c+d)]×100 ⑤ 妊娠状况(妊娠+空怀)与直肠触诊结果一致的比例[(a+d)/N]×100

Note: ① Proportion of pregnant cows with a positive PAG outcome [a/(a+c)]×100 ② Proportion of nonpregnant cows with a negative PAG outcome [d/(d+b)]×100 ③ Proportion of cows diagnosed as pregnant by PAG that were truly pregnant [a/(a+b)]×100 ④ Proportion of cows diagnosed as nonpregnant based on PAG that were truly nonpregnant [d/(c+d)]×100 ⑤ Proportion of pregnancy status outcomes (pregnant and nonpregnant)that were correctly classified by PAG [(a+d)/N]×100

表3 人工授精后75 d直肠检查结果评价28-45 d PAG ELISA试剂盒检测的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性Table 3 Sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV), negative predictive value (NPV), and accuracy of PAG 28-45 d after AI for determining pregnancy status75 d by rectal palpation

在本研究中，PAG ELISA试剂盒检测的特异性和阳性预测值分别为75.5%和86.5%，两种方法的差异性可能因为评估时间不统一。Silva等[4]的研究对试验牛只采集血液进行PAG检测后，立即应用B超进行妊娠诊断，所以两种诊断方法符合度很高。在本试验中，PAG ELISA试剂盒在母牛配种后28 d诊断妊娠状况，而该奶牛场直肠检查法在母牛妊娠75 d时具有较高的准确性，因此选取了75 d直肠检查的方法来评价PAG ELISA试剂盒检测的准确性。在母牛早期妊娠诊断时，由于PAG ELISA试剂盒检测法和直肠检查法两种孕检方法无法同时进行(间隔47 d)，因而无法对其特异性(直肠检查空怀样品中，PAG ELISA试剂盒法检测结果为阴性的比例)和阳性预测值(PAG ELISA试剂盒检测为已孕的牛只，确定为真实妊娠)进行客观评价，因为PAG ELISA试剂盒检测至直肠检查期间出现的胚胎死亡现象会干扰特异性和阳性预测值的评估[5]。另外，本试验牛场牛奶尿素偏高，尿素氮升高，也会造成奶牛子宫中尿素氮的沉积过量，从而导致奶牛的胚胎死亡[6]。本次试验结果未出现假阳性(PAG检测阴性，直肠触诊为妊娠)，这对牧场繁殖管理至关重要，使用PAG ELISA试剂盒不会将已孕牛只诊断为空怀，而致使繁育人员错误的为已妊娠牛只进行发情处理，造成已妊娠奶牛的流产。

4 小 结

早期妊娠诊断是通过及早发现空怀牛，并对其进行再处理和再次输精的方式，直接缩短产犊间隔。目前常用的直肠触诊法通常是在配种后60～90 d进行，与28 d使用牛妊娠相关糖蛋白诊断相比，对于一些发情表现不明显或者无发情表现的空怀牛就失去了14 d甚至更多及早处理的时间。牛怀孕检测试剂盒具有快速、准确、易于标准化等优点，适用于规模化化牧场的日常繁殖工作。

本试验在小规模群体应用后以评估PAG ELISA试剂盒法的准确性和该妊娠诊断方法的可操作性。如果对整个群体进行标准化应用，将对牛场带来不可低估的价值。牛怀孕检测试剂盒为奶牛场提供了一种全新的母牛诊断工具，能在配种后更早时间进行妊娠诊断，无疑对尽早发现空怀牛和缩短胎间距有很大帮助，有利于牧场提高奶牛场繁殖状况和经济效益，是规模化奶牛场一种理想的早期妊娠诊断方法。

参考文献:

[1] 钟 旭，薛立群，田见晖，等. 妊娠相关糖蛋白(PAG)在奶牛早期妊娠诊断上的应用现状[J].中国畜牧兽,2011, 38(11): 140-143.

[2] Green J A, Parks T E,Avalle M P, et al. The establishment of an ELISA for the detection of pregnancy-associated glycoprotiens(PAGs) in the serum of pregnant cows and heifers[J]. Theriogenoloy,2005, 63:1 481-1 503.

[3] Noordhuizen J P T M,Frankena K,Thrusfield M V, et al. Measurement of disease frequency. Application of Quantitative Methods in Veterinary Epidemiology[M].2nd ed. Wageningen Pers:the Netherlands. 2001： 63-82.

[4] Silva E,Sterry R A,Kolb D, et al. Accuracy of a Pregnancy-Associated Glycoprotein ELISA to Determine Pregnancy Status of Lactating Dairy Cows Twenty-Seven Days After Timed Artificial Insemination[J]. J Dairy Sci,2007, 90:4 612-4 622.

[5] Green J C, Volkmann D H,Poock S E, et al. Technical note: A rapid enzyme-linked immunosorbent assay blood test for pregnancy in dairy and beef cattle[J]. J Dairy Sci,2009, 92: 3 819-3 824.

[6] 马志愤.奶牛繁殖性能分析[J].新疆畜牧业.2011, 8: 61-62.