复方清热泻火汤活性成分提取工艺研究

陈 勇，王绍红

(荆州市中医医院药剂科，湖北荆州434000)

楼一层

(武汉理工大学化学工程学院， 湖北武汉430070)

“复方清热泻火汤”来源《会约》卷六加减，在医院临床应用多年。其中生地为玄参科多年生草本植物地黄 (Rehmannia glutinosa Libosch.)的新鲜或干燥的块根［1］，有清热凉血、益阴生津之功效［2］。李时珍对生地黄的评价是:“服之百日面如桃花，三年轻身不老”［3］。大黄为蓼科 (Polygonaceae)属多年生草本，根状茎及根供药用［4］，具有泻热通肠、凉血解毒、逐瘀通经的功效。用于实热便秘、积滞腹痛、湿热黄疸、血热吐衄、肠痈腹痛。复方清热泻火汤以生地、大黄为君药，配以白芷、黄芩、赤芍、防风、独活、甘草等6味药，具有清热凉血、凉血祛瘀等功效，临床上可用于治疗各种热血毒盛、发斑发疹、热毒痈疡等症状［5］。采用高效液相色谱法对中药中的有效成分进行含量测定已成为中药的质量评价和优化提取工艺的重要手段［6］。本文研究了不同提取方法对复方清热泻火汤中有效成分的影响，并对最佳的提取方法进行了正交试验的优化，找出影响因素，确定最优的提取工艺［7］。从整体上为复方清热泻火汤的有效活性成分提取工艺建立客观、有效的方法，并为复方清热泻火汤的质量标准提供参考。

1 仪器与试药

Waters 1525 Binary HPLCpump(美国waters公司);Waters 2998 photodiode Array Detector(美国waters公司)。AT20型分析天平 (十万分之一)，旋转蒸发仪 (上海亚荣科技有限公司)。KQ-300DE型数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司)。甲醇等为色谱纯 (Tedia公司，美国)，制样所用试剂均为分析纯。液相用水为三次重蒸水，大黄素对照品 (中国生物制品检定所，批号:110756-200110)。复方清热泻火汤药材 (生地、大黄、白芷、黄芩、赤芍、防风、独活、甘草)均购自安徽亳州中药材公司，经武汉理工大学化学工程学院楼一层教授鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 大黄素含量测定

2.1.1 色谱条件 ZORBAXC18(250mm×4.6mm，5μm)，检测波长254nm，柱温:30℃，流动相:甲醇-0.1%磷酸溶液 (80:20)，流速:1.0ml/min，进样量:20μl［8］。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取经五氧化二磷为干燥剂减压干燥24h的大黄素对照品25mg，精密称定，置于50ml容量瓶中，加甲醇定容，制成每1ml含500μg的溶液，即得。

2.1.3 标准曲线的绘制 分别取2.1.2中配制好的大黄素标准液1.0、2.0，4.0、6.0、8.0、10.0ml于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，静置。即得不同浓度的对照品溶液，分别进样20μl，于254nm波长处，测定峰面积，大黄素标准品液相色谱图见图1。以峰面积(y)对溶液浓度(x)进行线性回归。结果回归方程为:y=38002x+20866，r=0.9999。大黄素在50～500μg/ml范围内呈良好的线性关系，大黄素对照品浓度与峰面积标准曲线见图2。

图1 大黄素标准品液相色谱图

图2 大黄素对照品浓度与峰面积标准曲线

2.1.4 试样中大黄素的测定 取粗提取物一定量于50ml容量瓶中，按标准曲线的绘制方法，依次加入试剂，定容，再取1ml样品溶液于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，进样20μl，于254nm波长处测定峰面积，计算大黄素的含量，液相图谱见图3。

图3 复方清热泻火汤供试品液相色谱图

2.1.5 精密度实验 取同一大黄素对照品溶液，在最大吸收波长处重复测定5次，记录峰面积，根据标准曲线方程得到大黄素的含量，结果表明RSD为0.65%(n=6)，表明精密度良好。

2.1.6 重复性实验 取同一供试品溶液6份，分别进样20μl，记录峰面积，计算结果表明RSD=1.03%(n=6)，表明供试品溶液重复性良好。

2.1.7 稳定性实验 取同一供试品溶液在0、2、4、6、8、12、24h分别进样20μl，记录峰面积，结果表明RSD为0.97%(n=6)，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。2.1.8 回收率实验 精密量取同一方法制备的已知大黄素含量的供试品溶液6份，每份加入对照品溶液1ml，测定大黄素的含量。计算回收率，结果平均回收率为99.56%，RSD为1.24%(n=6)。

2.2 提取方法

2.2.1 索氏提取法 准确称取复方清热泻火汤处方药材28g粉碎使成粗粉，用滤纸包好，放入索氏提取器中，用80%乙醇提取，直至回流液无色，回收溶剂，烘干得到粗提物，分析产品并测定大黄素的含量［9］，所得大黄素的得率及数据见表1。

表1 索氏提取法提取复方清热泻火汤中大黄素的得率

2.2.2 超声波提取法 准确称取复方清热泻火汤处方药材28g粉碎使成粗粉，加入280ml的80%乙醇溶液，超声提取 (功率250W，频率40kHz)40min，回收溶剂，烘干得到粗提物，分析产品并测定大黄素的含量，所得大黄素的得率及数据见表2。

表2 超声提取法提取复方清热泻火汤中大黄素的得率

2.2.3 乙醇回流提取法 准确称取复方清热泻火汤处方药材28g粉碎使成粗粉，置于圆底烧瓶中，加入280ml的80%乙醇，置于电热套上进行回流提取1.5h，过滤，回收溶剂，烘干得到粗提物，分析产品并测定大黄素的含量，所得大黄素的得率及数据见表3。

表3 乙醇回流法提取复方清热泻火汤中大黄素的得率

2.3 乙醇回流法正交提取试验

表4 乙醇回流提取法正交试验因素水平表

表5 乙醇回流提取法提取复方清热泻火汤中大黄素正交试验结果

以大黄素的得率为主要考查指标，粗提取物的质量为参考指标，进行正交设计实验［10］。考查影响因素:乙醇浓度、乙醇用量、提取时间和提取次数对复方清热泻火汤活性成分中大黄素提取的影响。由文中表4、表5可知，A因素 (乙醇浓度)对大黄素的得率影响最大，随着提取乙醇浓度的升高而增大，D因素 (提取次数)其次，B因素 (乙醇用量)和C因素 (提取时间)对大黄素的得率影响最小，结合提取效率与成本考虑，故综合确定最佳的提取方案为:A3B2C1D3，即乙醇浓度85%，乙醇用量为药材的10倍量，提取时间为1h，提取次数为3次。

3 结 论

不同的提取方法对复方清热泻火汤中大黄素的提取效果比较结果表明，乙醇回流提取得率(0.65%)＞超声提取法 (0.60%)＞索氏提取法 (0.56%)。乙醇回流提取法的得率高于其余两种方法，所需仪器设备简单，操作方法成熟易行，相比之下，乙醇回流提取法提取复方清热泻火汤中大黄素的方法是最佳的选择。

使用乙醇回流提取法提取大黄素时，提取所用的乙醇浓度对大黄素得率的影响最大，其次为提取次数、乙醇用量和提取时间。乙醇回流提取法提取复方清热泻火汤中大黄素的适宜工艺条件为:提取所用乙醇浓度为85%，乙醇用量为10倍量的药材量，提取1h，提取3次。在此工艺条件下，大黄素提取物的得率可达到0.67%。

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