缺血性脑血管病患者血浆甘露糖结合凝集素检测及其启动子区多态性分析

杨新玲，康少平，程健君，辇晓峰，刘雪晴，贾天军（河北北方学院医学检验学院，河北 张家口 075000）

以动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）为主要病理改变的缺血性脑血管病（ischemic cerebrovascular disease，ICVD）是常见病、多发病，其病因和发病机制较为复杂，近年来感染因素、炎性反应在ICVD中作用得到高度关注［1］。病原体识别分子模式（pathogen recognition molecules pattern，PAMP）与相关模式识别受体（pattern recognition receptors，PRR）是研究的热点，而甘露糖结合凝集素（mannose binding lectin，MBL）是较重要的PRR［2］，且与多种疾病的发病有关。国外研究［3－4］报道：MBL基因突变与心肌梗塞及2型糖尿病患者心血管疾病发病率增加有关。MBL基因多态性与人循环系统中MBL寡聚体含量和功能活性相关，已发现6个对血清MBL水平影响最大的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）位点。由于MBL启动子区和结构基因多态性，血浆中MBL含量变动很大，电子显微镜观察到MBL二聚体到六聚体等不同的结构聚体形式，人血浆MBL主要以六聚体为主［5］，但在疾病中的研究较少。因此，本研究采用ELISA法和Western blotting法检测我国北方ICVD患者血浆MBL含量及存在形式，同时采用序列特异性引物－多聚酶链反应（SSP－PCR）技术分析MBL基因启动子区多态性，为ICVD的辅助诊断和治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker（大连宝生物公司）；琼脂糖、盐酸胍（Sigma公司，美国）；MBL ELISA试剂盒（北京现代高达生物技术有限责任公司）；鼠抗人的第一抗体（自制单抗）；HRP标记的羊抗鼠第二抗体（南京金思特公司）；预染蛋白 Marker（凯基），DAB显色液（哈尔滨海基生物科技有限公司）等。基因扩增梯度PCR仪、酶标仪（Thermo公司，日本）；凝胶图像分析系统（WD－9403F，北京）；稳压稳流电泳仪（DYY－7C型，北京）；电转膜仪（北京六一仪器厂）等。

1.2 研究对象 选取2006年2月—2007年5月于河北北方学院第一附属医院神经内科住院的81例ICVD患者作为ICVD组，其中男性52例，女性29例，年龄53～73岁，平均（65±12）岁，入选患者均符合全国第四届脑血管病学术会议修订的各类脑血管病诊断要点。患者入院后次日清晨，用2mL EDTA－K2抗凝管收集空腹静脉血标本。选取同期于河北北方学院附属第一医院保健科门诊进行健康体检者（颅脑CT或MRI均无异常表现）60例作为对照组，其中男性40例，女性20例，年龄50～70岁，平均（60±10）岁。2组研究对象性别、年龄间差异无统计学意义（χ2＝0.09，P＝0.761；t＝1.05，P＝0.32），具有可比性。

1.3 标本的处理 2h内取1.2mL抗凝全血放入1.5mL离心管中，5000r·min－1离心5min，分离血浆，－80℃保存，供测定血浆MBL含量及寡聚体；有形细胞成分用于提取DNA，供MBL启动子多态性检测。

1.4 ELISA法检测血浆 MBL含量 用 MBL ELISA试剂盒测定，严格按说明书操作，用酶标仪比色，波长为450nm。每批标本带有标准液，浓度分别为 0、1、2、5、10、25、50和100μg·L－1，以标准参考品制备的标准曲线，计算血浆样本中的MBL含量。

1.5 非还原SDS－PAGE和Western blotting法检测血浆MBL寡聚体 根据ELISA结果将血浆蛋白样品进行标化，与2×上样缓冲液［0.125mol·L－1Tris－Cl，4%SDS，20%（V／V）Glyceral，0.02%溴酚蓝］混匀，沸水浴5min，以使蛋白充分变性。Western blotting法参照《分子克隆实验指南》进行：按SDS－PAGE常规电泳方法，分别采用浓度为15.0%和7.5% 的分离胶。PVDF膜提前用甲醇浸泡10min，90V恒压冰浴转膜3h。5%脱脂奶粉室温封闭1h。0.1%PBST漂洗后，一抗（1∶500）4℃摇动孵育过夜，二抗（1∶2000）室温孵育1h。PBST漂洗后，按照DAB显色液操作说明显色MBL特异条带：将转印后的膜放于干净平皿中，加入现配的DAB显色液，室温放置5min，流水漂洗终止显色反应后拍照。样品的Western blotting检测均使用同一批试剂。

1.6 MBL启动子多态性分析 ICVD患者与健康人标本MBL基因启动子多态性的检测参照文献［6］。用含0.5mg·L－1溴化乙锭1%的琼脂糖凝胶电泳，DL 2000DNA Marker作为参照，对扩增产物进行分析。

1.7 统计学分析 采用SPSS 13.0软件包进行数据统计处理，组间各单倍型和基因型分布差异比较、组间性别均衡性检验采用χ2检验；血浆MBL含量比较、组间年龄均衡性检验采用两独立样本t检验。

2 结 果

2.1 血浆MBL含量 ICVD组和对照组受检者血浆MBL含量分别为（3372.18±660.90）和（2065.29±195.67）μg·L－1，2组比较差异有统计学意义（t＝14.83，P＜0.01）。

2.2 血浆MBL存在形式 由于MBL以不同相对分子质量的寡聚体存在，应用2种不同浓度的SDS－PAGE凝胶（15.0%和7.5%）对血浆中 MBL蛋白分子进行分离。15.0%分离胶 Western blotting结果显示：ICVD组患者 MBL单体（约36000）表达高于对照组。见图1。7.5%分离胶Western blotting结果显示：ICVD组患者MBL约250000寡聚体表达高于对照组；最为显著的是MBL约130000寡聚体的表达，在ICVD组能够清晰检测到表达条带，而在对照组几乎检测不到。见图2。

图1 血浆MBL 15.0%分离胶Western blotting检测结果Fig.1 Western blotting detection results of plasma MBL with 15.0%separating gel

图2 血浆MBL 7.5%分离胶Western blotting检测结果Fig.2 Western blotting detection results of plasma MBL with 7.5%separating gel

2.3 MBL启动子多态性在对照组和ICVD组中的分布 综合分析SSP－PCR的结果可确定MBL启动子单倍型与基因型在各组中的频数（表1和2）。检出6种单倍型：HXP、HYP、HYQ、LXP、LYP和LYQ。不同的单倍型中，HYP型人数最多，2组此型的构成比比较差异有统计学意义（χ2＝7.59，P＜0.05）；LXP单倍型频数ICVD组明显低于对照组（P＜0.05）。检出15种基因型，其中HXP／HYP和HXP／LYQ仅见于ICVD组，HXP／LXP和HYP／LXP则仅见于健康对照组。不同的基因型中，HYP／HYP型人数最多，2组此型的构成比比较差异无统计学意义（χ2＝3.53，P＞0.05）；ICVD组LYQ／LYQ 基因型频数明显低于对照组（P＜0.05）。

3 讨 论

目前怀疑肺炎衣原体是引发AS的重要病原。研究者［7］在对挪威患者的研究中得出MBL等位基因突变和严重的AS之间存在中等程度的相关性。加拿大患者突变的MBL等位基因与颈动脉斑块增加具有显著相关性［8］。这2个相对独立的研究结果均提示感染因子在AS中的作用。而MBL似乎可以调节肺炎衣原体感染的严重程度，这可能解释MBL基因突变与严重AS之间的关系。MBL蛋白基本结构是由3条相同约32000的多肽链构成的亚单位组成2～6个不等的寡聚体，电镜下观察呈“花束”样结构，与C1q分子类似。MBL的功能依赖于蛋白质的多聚化程度和血浆水平，结构基因变异可能会产生不同多聚化的产物，从而影响补体的激活，编码区上游的变异会影响MBL血清浓度。已发现与MBL相关的基因突变位点外显子Ⅰ的52位、54位和57位，以及启动区域和非编码区域的－550位、－221位和＋4位，所有这些突变位点可以发生在顺式结构或反式结构中，由此产生不同单倍型。单倍型可以定义不同的等位基因，转录产生不同结构和不同量的多肽［9］。

表2 2组人群MBL启动子各基因型的频数Tab.2 The genotype frequencies of MBL promoter region of people in two groups ［n（η／%）］

MBL以多聚体形式存在于不同种族野生基因型的人群中。Dean等［10］用免疫印迹实验证明：LX启动子单倍型对野生基因型和A／D基因型的人群MBL功能性寡聚体影响最大，能够降低高相对分子质量的寡聚体。蛋白质功能的发挥与其结构密切相关，本研究采用ELISA和Western blotting方法分析血浆MBL蛋白含量及存在形式，发现ICVD组血浆MBL含量明显高于对照组。ICVD组MBL单体含量较健康志愿者高，血浆中大量单体MBL蛋白分子存在，使MBL失去了各种保护功能，进一步揭示了MBL结构与功能的关系。此外，ICVD组MBL在相对分子质量为250000和130000左右的寡聚体表达高于对照组，推断ICVD患者MBL多聚体总的含量较健康对照组高。MBL作为急性期反应蛋白，机体不同的生理及病理状态均对MBL的表达产生影响，提示MBL在ICVD诊断和发生机制中起着重要的作用。本研究应用SSP－PCR方法对MBL启动子多态性进行了分析，结果发现：ICVD患者HYP、LXP单倍型与健康对照组HYP、LXP比较有统计学意义，其他4种单倍型HXP、HYQ、LYP和LYQ在2组标本中差异无统计学意义。检出15种基因型，其中HXP／HYP和HXP／LYQ仅见于ICVD患者，HXP／LXP和HYP／LXP则仅见于健康对照组；不同的基因型中，HYP／HYP型人数最多，2组此型的构成比较差异无统计学意义；ICVD组LYQ／LYQ基因型频数明显低于健康对照组，差异有统计学意义，提示MBL启动子单倍型和基因型频数在ICVD发生中起到一定的作用。

综上所述，ICVD与MBL启动子多态性及其血浆含量、蛋白存在形式有关，这在冠心病和AS的机制探讨及临床诊断中具有重要的意义，但其确切作用机制尚未完全阐明。由于血浆MBL受多个SNP位点影响，同时研究样本受地域和数量限制，MBL参与ICVD的具体作用机制尚需进一步研究。

［1］Denes A，Thornton P，Rothwell NJ，et al.Inflammation and brain injury：acute cerebral ischaemia，peripheral and central inflammation［J］.Brain Behav Immun，2010，24（5）：708－723.

［2］Park KH，Kurokawa K，Zheng L，et al.Human serum mannose－binding lectin senses wall teichoic acid Glycopolymer of Staphylococcus aureus，which is restricted in infancy［J］.J Biol Chem，2010，285（35）：27167－27175.

［3］Vengen IT，Madsen HO，Garred P，et al.Mannose－binding lectin deficiency is associated with myocardial infarction：the HUNT2study in Norway［J］.PLoS One，2012，7（7）：e42113.

［4］Siezenga MA，Shaw PK，Daha MR，et al.Low mannosebinding lectin（MBL）genotype is associated with future cardiovascular events in type 2diabetic South Asians.A prospective cohort study［J］.Cardiovasc Diabetol，2011，7（5）；10：60.Doi：10.1186／1475－2840－10－60.

［5］Teillet F，Dublet B，Andrieu JP，et al.The two major oligomeric forms of human mannan－binding lectin：chemical characterization，carbohydrate－binding properties，and interaction with MBL－associated serine proteases ［J］.J Immunol，2005，174（5）：2870－2877.

［6］苏 黎，余新沛，张丽芸，等.中国维吾尔族人群MBL基因启动子及第一外显子区SNP及其单倍型与基因型研究［J］.现代免疫学，2007，27（2）：99－102.

［7］Rugonfalvi－Kiss S，Endrész V，Madsen HO，et al.Association of Chlamydia pneumoniae with coronary artery disease and its progression is dependent on the modifying effect of mannose－binding lectin［J］.Circulation，2002，106（9）：1071－1076.

［8］Hegele RA，Ban MR，Andson CM，et al.Infectionsusceptibility alleles of mannose－binding lectin are associated increated carotid plaque area［J］.J Investig Med，2000，48（3）：198－202.

［9］Natio H，Ikeda A，Hasegawa K，et al.Characterization of human serum mannan－binding protein promoter［J］.J Biochem，1999，126（6）：1004－1012.

［10］Dean MM，Heatley S，Minchinton RM.Heteroligomeric forms of codon 54mannose binding lectin（MBL）in circulation demonstrate reduced in vitro function［J］.Mol Immunol，2006，43（7）：950－961.