含LacZ表达盒的鸭瘟病毒TK基因缺失转移载体的构建

杨承槐，李俊平，李启红，刘 丹，黄建华，蒋桃珍，李慧姣，夏业才

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

鸭肠炎病毒(duck enteritis virus，DEV)，俗称鸭瘟病毒，属于疱疹病毒科，能引起鸭、鹅等雁形目禽类发生急性、热性、败血性传染病。1923年荷兰首次报道了该病［1］。1957年，黄引贤在我国最早报道该病并分离到病毒［2－3］。该病毒拥有庞大的基因组，约158 kb［4］，可用作病毒活载体，表达外源基因。王继春［5］、柳金雄［6］构建了表达 H5N1 亚型禽流感病毒血凝素基因重组鸭瘟病毒，能有效地抵抗鸭瘟强毒和H5N1亚型禽流感强毒的攻击。

胸苷激酶(TK)基因是疱疹病毒非必需的主要毒力基因之一［7－8］;LacZ基因一种广泛应用的报告基因，其蓝白斑检测使用方便、灵敏度高。本文将LacZ表达盒插入鸭瘟病毒TK基因中，构建了TK基因缺失的转移载体。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 毒株和细胞 鸭瘟病毒C－KCE株由中国兽医微生物菌种保藏中心提供;SPF鸡胚由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司提供。

1.1.2 质粒和菌株 pMD18T simple载体为大连TaKaRa公司产品，pVAX1－LacZ为Invitrogen公司产品;DH5α受体菌由天根生化科技(北京)有限公司生产。

1.1.3 主要试剂 Ex Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、T4 DNA聚合酶为大连TaKaRa公司产品;胶回收试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品。

1.1.4 引物 根据GenBank已发表鸭瘟病毒CKCE株全基因组序列(Accession No.EU082088)合成一对引物，用以扩增含TK基因的2.7 kb同源重组臂，由上海Invitrogen生物公司合成。

上游引物DEV TK－F2:5’GCGAATTCGTGTAACCAACTGCCCATAA3’，添加EcoR I酶切位点;

下游引物DEV TK－R2:5’GCTCTAGAAACG CTGTCAGGATAGTCAA3’，添加Xba I酶切位点。

1.2 方法

1.2.1 鸭瘟病毒C－KCE株繁殖 取鸭瘟病毒C－KCE株种毒1支，用生理盐水1000倍，经绒毛尿囊膜接种11日龄SPF鸡胚，每胚0.2 mL，37℃培养120 h。收集48～120 h内死亡鸡胚的绒毛尿囊膜和尿囊液，－70℃保存备用。

1.2.2 鸭瘟病毒基因组DNA提取 取鸡胚尿囊液 437.5 μL，加入蛋白酶 K(20 mg/mL)12.5 μL、10%SDS 50 μL;56 ℃ 水浴 1 h;分别用酚、酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)、氯仿各抽提1次;取上清，加入1/10体积3 mol/L醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，－20℃放置30 min;12000 g离心10 min，沉淀用70%乙醇洗涤1次，沉淀溶于30 μL去离子水中，－20℃保存备用。

1.2.3 同源重组载体 pMD18T－TK2.7的构建同源重组载体的构建策略见图1。

图1 转移载体pTK-LacZ的构建

以鸭瘟病毒基因组DNA为PCR扩增模板，以引物DEV TK－F2和TK－R2扩增含TK基因的2.7 kb片段。PCR反应程序为:95℃预变性3 min;95 ℃ 1 min，52.3 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，35 个循环;72℃延伸10 min。

PCR产物用胶回收试剂盒回收后，连接到pMD18T simple载体，转化 DH5α，获得重组质粒pMD18T－TK2.7。将酶切鉴定正确的重组质粒pMD18T－TK2.7送上海Invitrogen生物公司测序。

用Xho I、EcoR V 对 pMD18T－TK2.7进行双酶切，切除TK基因第243～486 bp共244个碱基，造成TK基因缺失，用T4 DNA聚合酶补平末端;pVAX1－LacZ用 Nru I和 Nar I双酶切，回收含LacZ表达盒的4.1 kb片段，用T4 DNA聚合酶补平末端，通过平末端连接将 LacZ表达盒插入到pMD18T－TK2.7载体，转化 DH5α，从而获得了转移载体pTK－LacZ，用引物所带的两个内切酶EcoR I和Xba I对转移载体进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 TK基因PCR扩增及测序 PCR扩增出2.7 kb左右片段，与理论预期相符。重组质粒pMD18TTK2.7的测序结果表明，本试验扩增的片段序列与已发表序列同源性100%。

2.2 转移载体pTK－LacZ的构建 重组质粒pTKLacZ分别用EcoR I、Xba I酶切鉴定，结果EcoR I单酶切切出了1970 bp、3000 bp、4430 bp左右的三个片段，Xba I单酶切切出了1560 bp、7836 bp左右的两个片段(图2)，酶切结果与理论相符，说明LacZ表达盒成功地插入到TK基因中。

图2 重组质粒pTK-LacZ酶切鉴定

3 讨论与小结

基因工程重组活载体疫苗是用基因工程技术将病毒或细菌(常为疫苗弱毒株)构建成一个载体，把外源基因(包括重组多肽、肽链抗原位点等)插入其中使之表达的活疫苗，具有免疫效力高、成本低等优点，是未来疫苗研制的方向之一。Darteil等完成了表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒活疫苗的研究，免疫效果良好［9－11］，并在我国上市。

鸭瘟活疫苗具有良好的免疫原性，成年鸭免疫后第3天即可产生一定的免疫力，第4天就能抵抗强毒攻击，这为开发水禽活载体疫苗提供了有利条件。鸭瘟病毒是一种疱疹病毒，基因组很大，可表达外源基因作为活载体疫苗［12］，胸苷激酶(TK)基因是疱疹病毒非必需的主要毒力基因之一，同时也是复制的非必须基因。缺失TK基因的疱疹病毒能在分化细胞中复制，但在神经细胞的复制能力极弱，毒力不会返强。本研究选择鸭瘟病毒TK基因为靶基因，应用PCR技术扩增全长TK基因，利用TK基因内部存在的两个内切酶位点Xho I、EcoR V，切除TK基因第243～486 bp共244个碱基，造成TK基因缺失，然后LacZ报告基因插入该缺失区。

本研究成功构建了含LacZ报告基因的TK基因缺失的转移载体，为构建重组鸭瘟病毒奠定了基础。

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