明目“五子”对光损伤大鼠视网膜功能的保护作用

刘爱琴 叶河江 路雪婧

2成都中医药大学附属医院眼科

3成都中医药大学眼科

光化学损伤是视网膜光损伤中最普遍的一种损伤。其病理过程与年龄相关性黄斑变性等视网膜变性疾病有许多相似之处，主要表现为视网膜光感受器细胞的凋亡，是一个退行性变性过程〔1〕。多焦视网膜电图（multifocal electroretinogram，mfERG）的一阶反应能较好反应大鼠视网膜功能的损伤程度〔2〕。本实验采用大鼠视网膜光化学损伤模型作为研究对象，通过mfERG观察研究枸杞子、菟丝子、五味子、茺蔚子、楮实子（下称明目“五子”）对视网膜光化学损伤及损伤修复的影响，并探讨其对视网膜功能的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与仪器、药品

选用8周龄SD大鼠32只，雌性，体重150～170 g。动物由成都中医药大学动物实验中心提供（生产合格证号：川实动管质第99-11号）。多焦电生理系统为德国 Roland公司生产的 RETIscan（Version 3.11）视诱发反应图象系统。中药“五子”以常规剂量制成水煎剂。

1.2 分组及给药方法

随机选取8只大鼠作为正常对照组，其余24只造模后随机分为模型对照组、明目五子高剂量组、低剂量组，每组各8只。高、低剂量组：分别以临床成人剂量20倍（13 g生药/kg）、10倍（6.5 g生药/kg）的“五子”水煎剂灌胃，1次/d。模型对照组、正常对照组以中药等容量的生理盐水灌胃，1次/d。光照同时给药，共 14 d。

1.3 造模方法

参照文献〔3〕，采用自制光化学损伤装置。在光照架的6个面分别放置1根40 W的绿色荧光灯管（波长510～560 nm）。光照箱中心各方向平均照度为（1900±106.9）Lux，相当于大鼠正常活动时眼球水平的各箱壁的照度为2000Lux。动物房的室温控制在21～24℃，光照箱内的平均温度为22～25℃。所有实验动物在12 h明视（30～50lux）及 12 h暗视环境光照维持，自由摄食饮水，驯养10 d。10 d后将大鼠暗适应24 h，然后进入光照箱，接受24 h光照。大鼠不散瞳不麻醉，可在光照箱内自由活动，光照后送回暗环境中饲养。

1.4 测试指标及方法

给予中药“五子”灌胃14 d后，进行各项指标检测。

1.4.1 mfERG测定：用1.5 ml/kg的3%戊巴比妥钠行SD大鼠左下腹腔注射全麻，被检测眼托吡卡胺滴眼液充分散瞳，同时予1%的卡因点眼角结膜表面麻醉。大鼠暗适应 20分钟后，采用 Ball法〔9〕，刺激采用图形同心圆排列的61个六角形，用21寸显示器显示。61个六角形由计算机产生二进制m-序列的假随机序列交替显示亮帧和暗帧，单位格的局部ERG反应由计算机自动处理记录。刺激采用1∶4亮暗对比，即1个亮帧接着有4个暗帧，暗帧之后每个六角形按m-序列随机出现亮暗帧，反复进行，47 s一个时段，每次测试共记录4个时段。通频带5 Hz～300 Hz。各电极均与针灸针相连，R+极针灸针刺入角膜下方边缘，R-极针灸针于两眼眶上缘连线中点刺入皮下，针尖与骨膜相贴，地电极置于尾根部皮下。信号经放大器放大（×10 000）并滤过（1 Hz/1 kHz）。所有mfERG反应曲线均以第一个大的负波和正波，即N1波和P1波为分析对象。采用常规分析参数，即各同心环反应波进行分析。数值以各波反应密度（即单位面积的振幅值，nV/deg2）及各波潜时（ms）表示。

1.4.2 光镜下观察大鼠视网膜形态学改变及细胞凋亡：各组过量麻醉大鼠，角膜12点位缝线标记，立即摘除眼球（包括球后视神经2 mm），角膜穿通一小切口，浸泡于15%甲醛组织固定液中。24小时后沿标记缝线-视神经连线对剖眼球，去除眼前节和玻璃体，逐级酒精脱水，常规石蜡包埋，经视盘颞侧旁开1 mm做4 μm厚的切片，烘干备用。各组随机选取8只眼球，进行HE染色，采用计算机图像分析系统观察视细胞的结构形态，并测定视网膜外核层厚度，以此作为光感受器细胞丧失的评判指标；并采用TUNEL法检测视网膜细胞凋亡。凋亡指数以凋亡细胞占同一视野细胞总数的百分比表示，记数方法每张玻片测量5个独立高倍视野（×400）中阳性细胞数。

凋亡指数（AI）=阳性细胞核数/计测细胞核总数×100%。

1.5 统计学方法

采用SPSS 10.0软件进行分析。多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用q检验（S-N-K法），各项指标以均数±标准差（±s）表示。 以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 明目 “五子”对光损伤大鼠视网膜mfERG N1波反应密度的影响

模型对照组视网膜mfERG各环N1波反应密度均明显减弱（表1），与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。高剂量组视网膜各环N1波反应密度增强明显，与模型对照组比较各环差异均有统计学意义（P＜0.05），与正常对照组比较1～4环差异无统计学意义（P＞0.05），5 环差异有统计学意义（P＜0.05）。低剂量组与模型组比较，虽数值有差异，但无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 明目“五子”对光损伤大鼠视网膜mfERG P1波反应密度的影响

模型对照组视网膜mfERG各环P1波反应密度均明显减弱（表2），与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。高剂量组视网膜各环P1波反应密度增强明显，与模型对照组比较各环差异均有统计学意义（P＜0.05），与正常对照组比较各环差异无统计学意义（P＞0.05）。低剂量组与模型组比较，虽数值上有所差异，但无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠mfERG N1波反应密度的比较（nV/deg2）

表2 各组大鼠mfERG P1波反应密度的比较（nV/deg2）

2.3 光镜下病理形态学观察结果

正常对照组的视网膜形态正常，结构层次清楚，TUNEL标记只见到极少的凋亡细胞，内外节排列整齐，二者分界清晰。模型对照组外核层排列欠整齐，较薄，TUNEL标记只见到较多的凋亡细胞。高、低剂量组与模型对照组比较，视网膜外核层略厚，凋亡细胞较少。各组内、外节分界趋向清楚。

2.4 明目“五子”对大鼠视网膜外核层厚度的影响

从表1可见，光照后高剂量组视网膜厚度较模型对照组有所增加，二者差异有统计学意义（P＜0.01），低剂量组与模型对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。三者与正常对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。

表3 光照后各组大鼠视网膜外核层厚度比较（μm）

2.5 明目“五子”对大鼠视网膜光感受器细胞凋亡的影响

表4显示：与模型对照组比较，高剂量组视网膜外核层细胞凋亡（TUNEL标记）阳性率明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01），低剂量组与模型对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；三者与正常对照组比较均有显著性差异（P＜0.05）。

表4 各组大鼠视网膜光感受器细胞TUNEL标记阳性率比较

3 讨论

中医药对视网膜疾病的认识多从肝肾论述，且古人认为：“诸子明目”，多种子仁类药物都可以用于治疗眼部疾患，具有补益肝肾、活血利水等功效。中药“五子”（枸杞子、菟丝子、五味子、茺蔚子、楮实子）是中医眼科古代若干明目效方中补益肝肾最常用的药物，临床实践证实其对视网膜病变有良好的疗效，特别是防治视网膜损伤及促进损伤后的修复有着明显的优势。我们将其作为一个药组进行研究，观察其对大鼠视网膜光损伤功能的影响。

光化学损伤是视网膜光损伤中一种重要的损伤机制，它以不引起明显温度升高、低能量、相对较长时间的光照而导致视网膜组织病理变化为特征。研究表明视网膜的光化学损伤程度与光波的波长、光照时间、能量、视网膜的暗适应状态、虹膜色素的多少等有密切的关系。在一定的波长范围内，视网膜光化学损伤的敏感性随着光波波长的缩短而呈对数关系上升。为了评估人类日常生活中经常接触的可见光光谱中段的光线对视网膜损伤的情况，本实验对暗适应24小时后未经麻醉和散瞳的SD大鼠，采用波长 510～560 nm、平均照度为（1900±106.9）Lux 绿色荧光灯照射，尽可能模拟生活状态下造成的光化学损伤，而使研究更贴近日常视网膜损伤的情况。本课题前期研究表明光照后视网膜色素上皮层、外核层、内核层和神经节细胞层均有不同程度的损伤，细胞排列紊乱，外核层明显变薄，线粒体肿胀等，并出现细胞凋亡。本实验发现明目“五子”能够增加光损伤后大鼠视网膜厚度，减弱视网膜外核层细胞凋亡。

多焦视网膜电图技术是20世纪90年代由Sutter等人研制的应用m-序列控制伪随机刺激方法，同时分别刺激视网膜多个不同部位，用一个常规电极记录多个不同部位的混合反应信号，再用计算机作快速Walsh转换，将对应于视网膜不同部位的波形分离提取出来，并将视网膜各部位的反应密度构成立体地形图，从而定量和直观地评价视网膜功能〔4-8〕。mfERG可以通过不同的刺激方式引出不同的反应。一阶反应（first-order kernel，FOK）是视网膜对应于一个小区域的并在一个完整m-序列两种状态刺激的两个平均反应之差。对于黑白闪光刺激，在数值上一阶反应等于对白光刺激的平均反应。

国内外学者通过实验及临床研究均表明mfERG能较好地反应视杆细胞的病变。Ball等〔9〕通过减慢刺激频率以适应大鼠杆细胞较慢的恢复时间，成功获得大鼠mfERG图形，并对激光光凝术后的大鼠视网膜进行检测，图形明确显示了激光对视网膜的破坏，很好地反应了视网膜功能。我们前期实验亦表明mfERG的一阶反应能较好的反应视网膜功能损伤程度〔2〕。

本实验中，对大鼠进行光照后，mfERG一阶反应N1及P1波各环反应密度显著下降。给予一定量的“五子”治疗后的大鼠视功能较模型对照组恢复较好，表明明目“五子”对大鼠视功能有一定的改善作用。

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