一种新的免疫荧光-酶双重染色技术

唐和斌，陈倍璠，冷昌龙

(中南民族大学 药学院，武汉430074)

免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、半定量测定的一项技术［1，2］，根据标记物的不同可分为酶免疫组化、荧光免疫组化、亲和免疫组化、免疫金(银)细胞染色组化和免疫标记电镜技术等［3］.

免疫组化技术广泛运用于药理学和病理学研究.传统的免疫组织化学以免疫单染为主，近年来的双重免疫染色法是在一张切片上进行两种不同染色的方法，以了解不同细胞、组织、甚或同一种细胞内抗原之间的相互关系［4］.目前报道的双重免疫染色法有免疫组化和免疫组化、免疫组化和原位杂交、免疫组化和特殊染色等，而免疫酶法和免疫荧光双结合的染色检测方法鲜见.本文以疼痛研究中常用的原代细胞DRG培养细胞为对象，研究其培养系各型细胞中P物质及其受体NK-1R的定位关系，以建立这种新的免疫荧光-酶双重染色技术.

1 材料

1.1 试剂和仪器

L-Glutamine、DMEM培养基、马血清均(美国，GIBCO公司)，D-Glucose(美国，AMRESCO 公司)，兔抗鼠GFAP多克隆抗体，兔抗鼠SP多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，兔抗大鼠MAP-2多克隆抗体、兔抗鼠S100多克隆抗体、鼠抗鼠NK-1R多克隆抗体(英国，ABCAM)，Laminin、胶原酶(美国，SIGMA-ALORICH 公司)，Heal Force HF151/212培养箱(力康生物医疗科技控股集团)，荧光显微镜系统(日本，Nikon Eclipse Ti).

1.2 动物

Wistar雄性大鼠4只，6～9周龄，150～210 g(湖北省疾病预防控制中心，SCXK(鄂)2013-0005).动物实验和处理均遵照国际《The Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals》.

2 方法

2.1 DRG细胞分离和培养

大鼠饲养2d后脱颈处死，解剖取大鼠脊椎，沿经椎间孔剪开，暴露脊髓，镜下用镊子摘取DRG细胞放入冰冷的Hanks液.用胶原酶II/胰蛋白酶消化，吹打成单细胞悬浮液，接种于10%马血清 +DMEM培养基中，37℃ 5%CO2恒温培养箱中原代培养5d.

2.2 免疫荧光和免疫酶法标记P物质和NK-1R

荧光标记:DRG细胞培养5d后，用4%多聚甲醛固定细胞15 min，0.3%过氧化氢除去内源性酶，正常山羊血清室温封闭30 min，再滴加一抗P物质1︰100，NK-1R 4℃过夜，次日滴加二抗FITC标记羊抗兔 IgG 1︰1000，避光孵育40 min，封片观察.

DAB标记:用4%多聚甲醛固定细胞15 min，0.3%过氧化氢除去内源性酶，柠檬酸微波抗原修复，正常山羊血清室温封闭30 min，再滴加一抗P物质1︰100，NK-1R 1︰100 4℃孵育过夜，次日滴加聚合HRP的羊抗兔IgG 30 min，DAB显色，镜下控制发色时间，水溶性封片观察.

2.3 免疫荧光-酶双重染色标记P物质和NK-1R

DRG细胞培养5d后，4%多聚甲醛固定细胞15 min，0.3%过氧化氢除去内源性酶，正常山羊血清室温封闭30 min，滴加一抗MAP-2 1︰200，4℃孵育过夜，次日先进行柠檬酸抗原修复，再滴加一抗P物质抗体1︰100，4℃孵育过夜后，先滴加聚合HRP羊抗兔IgG，孵育30 min，再滴加FITC标记羊抗小鼠IgG，DAB显色，水溶性封片观察.

MAP-2和NK-1R、GFAP和 NK-1R，S100和 NK-1R双重染色操作步骤如上.

3 结果

3.1 DRG神经元活细胞生长状态观察

DRG细胞培养5d后在倒置显微镜下观察细胞形态如图1.由图1可见，DRG神经细胞大量生长，胞体较大呈圆形或椭圆形，明显可辨，折光性好，光晕强;施万细胞分枝明显延长并增粗，呈两端带有突起的梭形;神经突起网络变得稠密;成纤维细胞则为不规则的多角形，数量较多.

图1 DRG神经细胞Fig.1 The DRG cells of neurons

3.2 免疫荧光法和免疫酶法染色定位DRG细胞中P物质和NK-1R

通过免疫荧光法和免疫酶法定位原代培养的DRG细胞中P物质及NK-1R的表达，效果不佳.免疫荧光法(图2a，2c)中虽红色和绿色阳性标记与黑色背景对比较明显，但无法辨识DRG细胞结构，且P物质和NK-1R表达定位不清晰.免疫酶法(图2b，2d)中细胞结构相对比较清晰，但标记物区分度不强，且背景着色较深，会对P物质及NK-1R阳性结果的判定产生一定的干扰.

图2 免疫荧光法和免疫酶法分别染色的DRG细胞Fig.2 DRG cells stained by immunofluorescence and immunoenzyme staining

3.3 免疫荧光-酶双重染色定位P物质和NK-1R

结合免疫酶联法和免疫荧光法各自的优势，弥补二者的缺陷，便于观察免疫染色结果和定性半定量分析，本文在原代培养的DRG细胞中实现了免疫荧光-酶双重染色.

3.3.1 P物质和MAP-2免疫荧光-酶双重染色

用P物质抗体和MAP-2抗体(标记DRG神经元)进行免疫荧光-酶双重染色，获得了比较好的效果，结果见图3.图3(a～c)分别为镜下明场、荧光拍摄和明场荧光叠加的DRG细胞.由图3(a)可见，SP呈阳性位于DRG神经元中，图3(b)中绿色荧光为神经元的位置，图3(c)中SP表达的阳性区域，神经元也呈阳性，并可清楚地辨识细胞结构，P物质定位清晰，而免疫酶法和免疫荧光法分别染色无法实现P物质准确定位.由于P物质免疫阳性区域位于中小型神经元中，而不在非神经细胞中，可知P物质主要存在于DRG神经元中，即P物质主要由中小神经元合成和释放，与前期研究结果一致［5］.

图3 免疫荧光-酶双重染色定位的P物质Fig.3 Substance P located by immunofluorescenceenzyme double staining

3.2.2 NK-1R 抗体和 MAP-2/GFAP/S100 免疫荧光-酶双重染色

为验证免疫荧光-酶双重染色技术的稳定性和可靠性，进一步获得 NK-1R的位置信息，本文对NK-1R、DRG神经元和非神经元进行免疫荧光染色，其中对GFAP、S100抗体标记的是DRG非神经元，MAP-2抗体标记的是神经元，继而定位了NK-1R和神经元、非神经元的位置关系，证明了NK-1R位于DRG神经元内，结果见如图4.图4(a～c)中显示神经元和NK-1R染色阳性区域几乎重叠，说明NK-1R位于神经元中;(d～f)和(g～i)中显示DRG非神经元和NK-1R染色阳性区域几乎不存在重叠区域，说明NK-1R在DRG非神经元中不存在.

图4 免疫荧光-酶双重染色定位的NK-1RFig.4 NK-1R located by immunofluorescenceenzyme double staining

4 讨论

免疫组织化学染色方法中的免疫酶法和免疫荧光法在实验药理和病理研究中运用广泛，经历了从单一标记物到双重标记物甚至多重标记物的发展历程，为科学研究提供了重要的方法学支持.但免疫组织化学也存在诸多问题，尤其是免疫组织化学的质量参差不齐，尚无明确的质量控制和质量标准［6］.对于单一标记物免疫染色，何新明等［7，8］认为免疫组织化学技术受多步骤多环节多因素影响，存在误判和误诊，如假阴性和假阳性.黄华伟［1］认为荧光抗体存在光稳定性差、光漂白现象等严重问题.谢颖颖［9］研究了不同的固定及渗透方法对小鼠卵母细胞免疫荧光染色的影响.对于双重免疫染色，路菊［10］认为两个一抗的搭配和协调最重要.对于免疫酶法目前已实现多重酶标记，但显色物种类太多后，阳性标记之间会产生串色，无法准确判定阳性和阴性，显色物浓度与时间难以把握，浓度过高或时间过长均会造成特异性染色深或假阳性，也可能增加背景染色［6］.

本文结合研究原代培养的DRG细胞中P物质和NK-1R的定位，对比分析单独使用免疫酶法和免疫荧光法染色的结果发现，免疫荧光法中红色和绿色阳性标记与黑色背景对比较明显，但是无法辨识DRG细胞结构，且P物质和NK-1R表达定位不清晰.免疫酶法单一标记中DRG细胞结构比较清晰，但背景着色较深，会对P物质和NK-1R阳性结果的判定产生一定的干扰.而本研究建立的免疫酶联和免疫荧光的结合的酶联-荧光双重染色法中，既能清晰地辨明DRG细胞结构，又可对标记物清晰区分，避免了两张切片上分别进行免疫酶法和免疫荧光法染色后再进行细胞定位和定性的统计学处理时出现的误差和争论，为实现对标记物的定性和半定量分析提供了重要帮助.

［1］黄华伟，杜美菊.免疫荧光分析的研究进展［J］.应用化工，2007，36(4):395-397.

［2］司京玉，聂生东，陈 瑛，等.免疫组织化学显微图像分析技术进展［J］.国外医学工程分册，2002，25(3):117-121.

［3］陈文华，张映.免疫组织化学技术在神经生长因子研究中的应用［J］.中国畜牧兽医，2006，33(11):61-64.

［4］楚天骄，雷冬梅，王玉萍，等.应用双重免疫组化染色法研究P53与细胞角蛋白在鼻咽癌中的表达［J］.中国实用医药，2007，2(2):5-6.

［5］Tang H B，Li Y S，Nakata Y.The Release of Substance P From Cultured Dorsal Root Ganglion Neurons Requires the Non-neuronal Cells Around These Neurons［J］.J Pharmacol Sci，2007，105(3):264 – 271.

［6］陈 杰，郑 杰，霍临明.重视免疫组织化学的质量控制和标准化［J］.中华病理学杂志，2005，34(2):65-66.

［7］何新明，罗颖洁，杨 通，等.免疫组织化学染色技术常见问题的研究与探讨［J］.中国免疫学杂志，2011，27(S1):1188-1194.

［8］郑 晖，罗洪英，颜亚晖.免疫组织化学技术常见问题分析及对策［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2007，16(1):126-128.

［9］谢颖颖，邵 华，郑俊克，等.不同的固定及渗透方法对小鼠卵母细胞免疫荧光染色的影响［J］.上海交通大学学报:医学版，2008，128(3):349-352.

［10］路 菊，孙 玮，陈德英.免疫荧光双重染色的激光共聚焦显微镜样品制备及观察［J］.免疫学杂志，2007，23(3):344-345.