稳定表达Tax基因HTLV-1细胞系的建立

夏 云

(郑州市卫生学校，郑州450000)

成人T 细胞白血病(adult T-cell leukemia，ATL)是严重危害人类健康的一种疾病，是由人类T细胞白血病I 型病毒(human T-cell leukemia vires type-1，HTLV-1)感染所致的一种特殊类型白血病，均见于成人起病［1］。尽管目前采用多种治疗方法，但对于急性或淋巴瘤型ATL 的预后还是很差。该研究应用脂质体介导法将含有neo 基因的PCMV -Tax 载体质粒和PCMV 空载体质粒分别转染T 淋巴瘤Jurkat 细胞系，利用G418 的药物选择特性对转染细胞进行压力筛选获得稳定表达外源基因的细胞，并对其进行鉴定。模拟成人T 淋巴细胞白血病细胞，从而为进行下一步的相关研究奠定了基础。也为临床揭示肿瘤进展提供重要的标志，有利于肿瘤的早期发现和治疗［2］。

1 实验材料

1.1 主要试剂 TRNzol -总RNA 提取试剂(北京天为时代科技有限公司);逆转录试剂盒(Promega公司);聚合酶链式反应试剂盒(北京天为时代科技有限公司);G418 (美国 sigma 公司);liporectamin2000(脂质体)美国Invitrogen 公司;JurkatE6-1 细胞系为本实验室提供;TfxTM-50Reagent 转染试剂盒(Promega 公司)。

1.2 引物

β-actin:

上游引物序列为:5’- TGA CGG GGT CAC CCA CAC TGT GCC CAT CTA -3’，下游引物序列为:5’- CTA GAA GCA TTG CGG ACG ATG GAG GG -3’，扩增片段长度为:660bP。

Neo:

上游引物序列为:5’-TCT GAT GCC GCC GTG TT-3’，下游引物序列为:5’-GAT GTT TCG CTT GGT GGT-3’，扩增片段长度为:324 bp。

Tax:

上游引物序列为:5’- CAGGGTTTGGACAGAGTCTT-3’，下游引物序列为5’-GATAAGGAACTGTAGAGCTG - 3’，扩增片段长度为:202 bp。

以上引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

2 实验方法

2.1 细胞的准备 Jurkat 细胞接种于10%灭活小牛血清的新鲜1 640 培养液中，内含100 U/ ml 青霉素、100 U / ml 链霉素，37 ℃饱和湿度、5% CO2培养箱中培养，2 ～3 d 传代1 次，调整细胞密度不超过5 ×105/ml。

2.2 G418 对Jurkat 细胞最小致死量测定 将细胞传至25 ml 培养瓶中每瓶加3 ml 细胞生长液，按下列浓度加G418:100，200，300，400，500，600，700，800，900，1 000 μg/ml 继续培养观察细胞生长及死亡情况每天换液一次仍以上述浓度加G418 两周内使细胞全部死亡的最小浓度即为最小致死量［3］。

2.3 脂质体转染(使用试剂盒LipofectamineTM2 000转染)

方法:Jurkat 细胞分别转染PCMV-Tax 载体和PCMV 空载体两组质粒。

(1)转染当天每孔(24 孔板)加入1 ml 无抗生素的培养基含5 ×105个细胞;

(2)对每种转染样本准备以下DNA -脂质体混合物:

①用50 μl 无血清培养基稀释3 μg DNA，轻轻混匀;

②在使用前临时将所需的10 μl 脂质体用50 μl 无血清培养基稀释，轻轻混匀，室温孵育5min;

③孵育5 min 后，将稀释的DNA 和稀释的脂质体轻轻混合，室温孵育20 min 以利于DNA-脂质体复合物形成。

(3)将DNA -脂质体复合物加入到含细胞和培养基的培养孔中，震荡培养板轻轻混合。

(4)转染24 h 后将细胞以1∶10 的稀释比例传到新鲜的培养基中，培养基中加入筛选剂G418(600 μg/ml)继续培养。21 d 后未转染细胞基本全部死亡，用含G418 (300 μg/ml)的1 640 培养基继续进行维持筛选，即为G418 抗性Jurkat 细胞。

2.4 细胞基因DNA 的制备:酚/氯仿抽提的方法制备细胞的DNA(略)。

2.5 抗性细胞PCR 鉴定

①反应体系

10 ×PCR Buffer 2.5 μl DMSO 1.5 μl 2.5 mM dNTPs 2.5 μl Neo primer F 1.0 μl Neo primer R 1.0 μl DNA template 1.0 μl Taq 酶 0.5 μl ddH2O 15.0 μl 25.0 μl

②反应条件

温度 时间 循环96 ℃ 5 min 1 94 ℃ 50sec 30 55 ℃ 50sec 72 ℃ 50sec 72 ℃ 5 min 1

用1. 0% 琼脂糖凝胶电泳进行扩增产物的分析。

3 实验结果

3.1 G418 对Jurkat 细胞的最小致死量测定结果经反复试验浓度确定为600 μg/ml，700，800 μg/ml的G418 均可将Jurkat 细胞杀死而浓度为400，500 μg/ml 的G418 虽可杀死部分细胞但仍有存活的细胞。故确定600 μg/ml 的G418 为Jurkat 细胞的最小致死量浓度，300 μg/ml 的G418 为Jurkat 细胞的维持浓度。

3.2 检测TaxP 和TaxN 细胞基因组DNA( 见图1)

图1 TaxP 和TaxN 细胞基因组DNA 的提取

3.3 PCR 检测neo 基因的转染 用600 μg/ml 浓度的G418 对转染的Jurkat 细胞进行筛选3 周后，用含G418(300 μg/ml)的1 640 培养基继续进行维持筛选1 周，PCR 检测neo 基因在其中整合的结果。用所设计的特异引物Neo 对TaxP，TaxN 和未转染的细胞进行PCR 扩增，电泳结果显示:TaxP，TaxN 均能扩增出约324bp 的特异片段，未转染的细胞没有扩增出特异片段(见图2)，说明转染细胞表达载体已整合到基因组中。

图2 PCR 检测neo 基因的转染A Marker3000 B TaxP 细胞组C TaxN 细胞组D 未转染的细胞组

3.4 检测所提取的总RNA 提取的RNA 产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳观察、检测可见28S 与18S亚基rRNA 的两条清晰带，提示RNA 纯度较高，完整性好(见图3)。

图3 总RNA 琼脂糖电泳扫描图

3.5 RT-PCR 检测转染细胞中Tax 基因的表达见图4。

图4 RT-PCR 检测Tax 基因mRNA 表达

4 结果讨论

HTLV-1 感染CD4+T 细胞而导致T 细胞的转化，起主要作用的是H TLV-1 的TAX 蛋白。TAX 蛋白本身并无DNA 结合能力，它通过与宿主细胞转录因子的直接或间接作用激活病毒和宿主细胞基因。通过与这些转录因子的相互作用，TAX 不仅可激活病毒自身的长末端重复序列的转录，也可激活一些即早期血清反应基因、细胞因子基因和其受体基因。这些细胞基因的激活导致T 细胞的增殖、转化，并与其它因素一起参与ATL 的发生。为了更好地研究HTLV-1 病毒TAX 蛋白对T 细胞内相关基因的影响及在ATL 发病中的作用，笔者将Tax 基因真核表达载体PCMV-tax 及空载体PCMV-neo 用脂质体分别转入JurkatE6-1 细胞，并经G418 筛选和RTPCR 扩增Tax 基因鉴定。经过以上实验，证明获得了稳定转染PCMV-Neo-Tax 基因的细胞株和稳定转染空载体PCMV-Neo-Bam 的Jurkat 细胞株，为以后的实验研究提供了良好的细胞模型，为进行下一步的相关研究奠定了基础。

［1］Tomita M. Inhibition of heat shock protein-90 modulates multiple functions required for survival of human T - cell leukemia virus type I-infected T-cell lines and adult T -cell leukemia cells［J］.Oncogene，2007，406(2):317 -323.

［2］Yoshida M. Discovery of HTLV-1，the first human retrovirus，its unique regulatory mechanisms，and insights into pathogenesis［J］.Oncogene，2004，24:5 931 -5 937.

［3］Richardson PS，Cooke K，Gerrish P，et al. Natural killer and lymphokine activated cytotoxicity following anaesthesia in patients with uveal malignant melanoma［J］. Melanoma Res，2010，7(2):129 -137.