香菇杂交子及其亲本液体发酵基因差异表达与胞内总糖含量杂种优势的相关性研究

吕 盈，吴娇娇，付立忠，程俊文，张红玉,3，李海波，魏海龙，许修宏

（1.东北农业大学 资源与环境学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.浙江省林业科学研究院 浙江省森林资源生物与化学利用重点实验室，浙江 杭州 310023；3.河北师范大学 生命科学学院，河北 石家庄 050016）

杂种优势现象实际上是亲本基因系统在杂合子内相互作用的结果，是杂合子内基因表达调控的外在表现形式。近年来，通过分子手段探讨杂种与亲本基因表达差异已在农作物[1～7]、蔬菜[8]、林木[9]、畜禽[10～12]等领域广泛展开，并取得了一些重要结论。如，玉米杂种优势的形成不仅与基因的表达与否相关，还与大量基因的上调或下调表达相关[4]。小麦穗下节间及株高杂种优势的形成可能与杂交种和亲本的穗下节间大量涉及细胞分裂、膨大和物质代谢、转录调控等过程的基因的差异表达有关[3]。抗虫杂交棉盛花期叶片中的基因显性表达和杂种特异表达则有利于产量形成和杂种优势发挥[6]。然而，有关基因差异表达模式与食用菌杂种优势的相关性研究目前还较为少见。

差异显示反转录PCR技术（DDRT-PCR）是在基因转录水平上研究杂种优势遗传机理的一种有效方法[13]。本研究选用庆科20、Cr02、申香9号、武香1号4个香菇菌株，通过原生质体单核体制备、单核体交配型测定、杂交组合配制，采用mRNA差异显示技术，分别检测了3个香菇杂交组合的17个杂交子与4个香菇亲本菌株在菌丝体培养阶段mRNA差异表达，分析了差异表达模式与液体振荡培养菌丝胞内总糖含量的相关关系，旨在从转录水平上揭示出一些与香菇液体发酵菌丝胞内总糖含量杂种优势形成有关的分子信息，为揭示香菇杂种优势形成过程中的一些重要现象和探索杂种优势的遗传机理提供更多的资料。

1 材料和方法

1.1 供试材料

香菇亲本菌株庆科20、申香9号、武香1号、Cr02由浙江省林业科学研究院生物技术研究所保藏。

1.2 方法

1.2.1 杂交子获得 供试亲本菌株原生质体单核体制备、单核原生质体杂交参照文献[14]。

表1 引物编号和序列Table1 Code and sequences of prime

1.2.2 引物 所用引物由上海生工合成，引物编号和序列见表1。

1.2.3 RNA的提取 亲本和杂交子菌株菌丝培养参照参考文献[15]，总RNA提取采用TRIZOL法，具体参照产品说明书，经1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。

1.2.4 反转录、DDRT-PCR反应及差异显示 参照BioRT逆转录扩增试剂盒进行反转录，具体参照说明书，取RNA0.2 μg，用3条锚定引物（B0327-B0329）逆转录合成第一链。用10条随机引物（表1）和3条锚定引物进行DDRT-PCR扩增，反应体系为：10×Buffer 2.5 μL，1.5mMMgCl2，200 μM锚定引物，0.5 μM随机引物，Taq酶 1U。反应程序：94℃ 5 min，94℃ 30 s，40℃ 2 min，72℃ 1 min，40个循环，72℃ 5 min。取5 μL扩增产物，经非变性8%聚丙烯酰胺凝胶（30%丙稀酰胺26.6 mL，10X TBE10.0 mL，水61.3 mL，3%过硫酸铵2.1 mL，Temed 134 μL）电泳恒功率70 w，电泳2 h后银染。

1.2.5 统计分析 统计分子量在100 ～ 1 400 bp的条带，扩增条带存在时赋值为1，没有条带则赋值为0。为增加试验的可靠性，实验中对每个引物组合均PCR扩增2次，仅统计稳定扩增的条带。将每种差异表达带型的数量作为变量，与所有杂交子液体发酵菌丝胞内总糖含量性状表现和超亲优势进行相关性分析。相关分析采用SPSS软件。

液体发酵菌丝体胞内多糖含量测定采用苯酚—硫酸法[16]。

2 结果与分析

2.1 香菇差异显示图谱及表达模式的统计结果

重复性好，条带清晰的10个引物对共扩增出16 993个条带，其中有6 017条表现出多态性，差异表达比例为35.41%。杂交子和亲本间差异表达的条带可概括为4种类型（图1）：双亲共沉默类型（110、W1），即该条带在双亲都有，而杂交子中没有；（2）单亲表达沉默类型（100＋010、W2），即该条带仅出现在亲本之一，而在另一亲本和杂交子中没有出现；（3）杂交子特异表达类型（001、W3），即该条带仅在杂交子中出现，而在双亲中均不出现；（4）单亲表达一致类型（101＋011、W4），即该条带在双亲之一和杂交子中出现，而在另一亲本中不出现。这些不同的差异表达类型在不同杂交子之间存在明显差异（表2）。不同杂交子各种差异带型所占比例不同，但均以W4为最高，W1和W3最少。W1平均为5.30%，W2为10.15%，W3为7.88%，W4为12.05%。

图1 香菇杂交子与亲本间基因差异表达类型Figure1 Patterns of gene expression between hybrids and their parents

2.2 基因差异表达模式与杂交子胞内总糖含量、超亲优势的相关分析

4种基因差异表达模式（表2）与杂交子液体发酵菌丝胞内总糖含量、胞内总糖含量超亲优势（表3）相关分析结果表明，单亲基因表达沉默（W2）与胞内总糖含量呈极显著正相关，杂交子基因特异表达（W3）与胞内总糖含量呈显著负相关。双亲基因表达共沉默（W1）、单亲基因表达一致（W4）与胞内总糖含量相关不显著。双亲基因表达共沉默（W1）、杂交子基因特异表达（W3）与胞内总糖含量超亲优势呈极显著正相关，单亲基因表达一致（W4）、单亲基因表达沉默（W2）与胞内总糖含量超亲优势呈显著或极显著负相关（表4）。

表4 差异表达模式与香菇杂交子胞内总糖含量及其超亲优势相关分析Table4 Correlation of patterns of differential expression with intracellular polysaccharide content and its over-parent heterosis of L.edodes hybrids

3 讨论

杂种优势的产生，涉及到两个遗传背景不同的体系的相互作用。在相互作用过程中，双亲基因的相互促进和抑制决定了杂交子基因表达。本研究首次发现，香菇杂交子及其亲本液体发酵存在基因差异表达，并且发现杂交子和亲本间基因差异表达类型的比例为35.39%。在田曾元等对玉米[17]、王章奎等对小麦[18]、Xiong等[19]对水稻的亲本与杂种间基因表达与杂种优势间关系的研究中同样发现，亲本与杂种间不同程度的存在基因的差异表达。尽管本研究中基因差异表达类型所占比例与上述研究差异表达类型所占的比例不同，但至少表明杂交子不同于亲本的基因差异表达现象是普遍存在的，且杂交子的遗传表现不是亲本遗传物质的简单相加，而是两套基因在杂种中相互作用，由此推测基因表达的调控机制与杂种优势的形成更值得关注。

本研究发现，杂交子基因特异表达（W3）与胞内总糖含量超亲优势呈极显著正相关，即杂交子在杂合状态下能够激发某种机制，表达一些新的基因产物，调控参与代谢基因的各种生理生化反应，从而表现出杂种优势。这与王章奎等[18]、吴利民[20]的结果相似。同时本研究还发现双亲基因表达共沉默（W1）与胞内总糖含量超亲优势也呈极显著正相关。这与吴敏生等[21]的结果相似。即某些基因在F1的表达受到抑制的情况下对产生正向杂种优势可能有利。这可能暗示了不但只在杂交种中特殊表达的基因，对形成杂种优势是起积极促进作用的，而且在形成杂交种的基因表达调控过程中，双亲的某些不利基因表达由于受到例如甲基化作用、反式作用因子等的抑制作用而不表达，从而形成杂种优势。

本研究中，单亲基因表达沉默（W2）、单亲基因表达一致（W4）与杂交子胞内总糖含量呈显著或极显著负相关。这与田曾元等对玉米[17]、王章奎等对小麦[18]的试验结果不同。田曾元等[17]研究发现，单亲表达沉默与玉米杂种优势关系最密切，认为对于单亲表达的基因来说，该基因在杂交种中被抑制有利于杂种优势的形成。而王章奎等[18]认为，单亲表达一致型对杂种优势的产生有着积极的作用。这也许是因为不同生物杂种优势形成的遗传机制有所不同造成的结果。

[1]熊建华，陈学峰，张义平，等.红莲型杂交水稻红莲优6号及其亲本苗期与分蘖期根系基因表达差异分析[J].中国水稻科学，2004，18（2）：94－98.

[2]谢晓东，倪中福，孟凡荣，等.小麦杂交种与亲本发育早期种子的基因表达差异及其与杂种优势关系的初步研究[J].遗传学报，2003，30（3）：260－266.

[3]张一，倪中福，姚颖垠，等.小麦杂交种与亲本之间穗下节间基因差异表达分析[J].作物学报，2008，34（5）：770－776.

[4]Wang X J, Cao H H, Zhang D F,et al.Relationship between differential gene expression and heterosis during ear development in maize (Zea mays L.).J Gen Genom, 2007, 34（2）：160－170.

[5]张君，王丕武，闫冬生，等.大豆杂交种及其亲本苗期叶片基因差异表达与杂种优势的关系[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2010，38（2）：91－100.

[6]Xing C Z, Zhao Y L, Yu S X,et al.Relationship between gene differential expression of leaves in full opening flower stages of hybrids ＆ their parents heterosis in pest-resistant cotton[J].Act Gen Sin, 2006, 33（10）：948－956.

[7]朱新霞，朱一超，艾尼江，等.中棉所12及其选系配制的4个杂交棉幼苗期基因差异表达[J].作物学报，2009，35（9）：1 637－l 645.

[8]吴才君，曹家树，董德坤.芸薹种蔬菜杂交种及其亲本莲座期基因差异表达与杂种优势的关系[J].中国农业科学，2004，37（11）：1 654－1 659.

[9]徐进，李帅，李火根，等.鹅掌楸属植物生长旺盛期叶芽基因差异表达与杂种优势关系的分析[J].分子植物育种，2008，6（6）：1 111－1 116.

[10]王栋，张沅，孙东晓，等.纯种与杂种鸡之间肝脏组织基因差异表达及其与肉用性状杂种优势的关系[J].遗传学报，2004，31（3）：257－264.

[11]王慧，张沅，孙东晓，等.蛋鸡与肉鸡卵巢组织基因差异表达与产蛋数杂种优势的相关性研究[J].畜牧兽医学报，2005，36（2），111－115.

[12]王金玲，单雪松，杨雨江，等.北京鸭/番鸭杂交体系肝脏组织基因表达差异的研究[J].家畜生态学报，2009，30（1）：20－22.

[13]Liang P, Pardee A B.Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction[J].Science, 1992（257）：967－971.

[14]张美彦，谭琦，陈明杰，等.香菇135菌株特异SCAR标记在其原生质体单核中的分布[J].菌物学报，2008，27（2）：252－257.

[15]Fu L Z, Zhang H Y, Wu X Q,et al.Evaluation of genetic diversity in Lentinula edodes strains using RAPD, ISSR and SRAP markers [J].World J Microbiol Biotech, 2010（26）：709－716.

[16]付立忠，吴学谦，李明焱，等.灵芝品种子实体多糖和三萜含量分析与评价[J].中国食用菌，2009（4）：38－40.

[17]田曾元，戴景瑞.利用cDNA-AFLP技术分析玉米灌浆期功能叶基因差异表达与杂种优势[J].科学通报，2002，47（18）：1 412－1 416.

[18]王章奎，倪中福，孟凡荣，等.小麦杂交种及其亲本拔节期根系基因差异表达与杂种优势关系的初步研究[J].中国农业科学，2003，36（5）：473－479.

[19]Xiong L Z, Yang G P, Xu C G,et al.Relationships of differential gene expression in leaves with heterosis and heterozygosity in a rice diallel cross[J].Molec Breed, 1998（4）：129－136.

[20]吴利民.小麦杂交种和亲本间基因差异表达模式与杂种优势的关系[D].北京：中国农业大学，2002.

[21]吴敏生，高志环，戴景瑞.利用cDNA-AFLP技术研究玉米基因的差异表达[J].作物学报，2001，27（3）：339－342.