miR－31在人结肠癌细胞系HT－29对RhoBTB1表达的影响

徐瑞斯，张 斌

（吉林大学中日联谊医院 内镜中心，吉林 长春130033）

结肠癌（colon cancer）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，每年死亡病例居各种恶性肿瘤第三位［1］。目前为止，根治结肠癌最有效的方法还是手术切除联合化疗，对于局部肿瘤5年生存率达到93%［2］。microRNA（miRNA）是一种大小19－24个核苷酸的非编码单链小RNA分子，能够通过排序这些基因的3’段非编码区调整下游目标基因，参与细胞增殖、分化、凋亡等多种重要细胞活动的调控［2］。迄今为止，人们发现了1500多种miRNA序列［3］。越来越多的证据表明miRNA在肿瘤的发生和进展中起着非常重要的作用［4，5］，很多miRNA在肿瘤中的表达是上调的或者是下调的［6，7］。

miRNA－31在恶性肿瘤的发生中起着非常重要的作用。有报道称miRNA－31结肠癌表达是显著上调，而且其表达水平在结肠癌的各个阶段是相互关联的［8，9］。有报道称 miRNA－31与结肠癌的侵袭和转移有关，抑制miRNA－31的表达可以影响结肠细胞的迁移和侵袭［10］。RhoBTB是Rho家族小分子鸟苷酸三磷酸酶（Rho GT Pases），是RhoBTB亚家族成员。最近报道指出在头颈癌中，RhoBTB1也是一种抑癌蛋白［11］。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人结肠癌细胞株HT－29来自于美国标准生物品收藏中心（ATCC），为复旦大学李志刚老师惠赠。90%RPMI1640培养基，10%胎牛血清，加100U／ml青霉素和100U／ml链霉素，于37℃，5%CO2培养箱中培养。

1.2 细胞转染 对照RNA和miR－31mimics分别转染HT－29细胞。将细胞在转染之前24h接种到24孔板上（2.5－3×104／well）。取1μl转染试剂 Lipofectamine 2000（Invitrogen）加入50μl（不含抗生素及血清）培养液中，同时将1.25μlmiR－31mimics储存液加入50μl（不含抗生素及血清）培养液中。将两者混匀后加400μl（不含抗生素及血清）培养液，加入培养液清洗后的培养细胞上。37℃培养5－6h，换液。37℃5%CO2培养箱培养48h之后，收集细胞进行检测。

1.3 预测靶基因 使用在线miRNA靶基因预测数据库（http：／／www.targetscan.org），我们假定RhoBTB1是miR－31的靶蛋白。（如图1A）

1.4 荧光素酶报告基因载体的构建 采用PCR方法扩增RhoBTB1基因的3’UTR序列，并构建其突变型序列，扩增出来的序列经酶切后，连入pGL3载体萤火虫荧光素酶序列的3’端，所有构建好的质粒均经DNA测序检验。

1.5 荧光素酶基因报告分析 将培养好的细胞于转染之前24h接种到24孔板中，将荧光素酶报告质粒与miR－31mimics共同转染细胞，48h之后进行荧光素酶活性的测定。

1.6 RT－PCR 用TRIzol试剂（Invitrogen）从细胞和肿瘤组织中提取总RNA。我们用茎环RT－PCR方法进行miR－31的检测。RhoBTB1mRNA的检测使用M－MLA反转录系统（Promega）将RNA逆转录 成cDNA。qRT－PCR的使用SYBR Green qPCR Master Mix（Tiangen）在 ABI 7300（Applied Biosystems，Foster，CA）。GAPDH作为内参。

1.7 western－blotting 按指示转染后，细胞收集并在RIPA裂解缓冲液（150mM NaCl，10mM Tris，pH7.5，1%NP40，1%脱氧胆酸盐，0.1%SDS，蛋白酶抑制剂混合物（sigma））裂解和使用Bradford protein assay（Bio－Rad，Hercules，CA）测定总蛋白。等量的蛋白样品进行10%SDS－PAGE电泳，并转移到PVDF膜（Millipore，Billerica，USA），室温下在5%脱脂牛奶封闭30min，然后室温下在anti－RhoBTB1（1∶2000，Abcam）中孵育2h，随后室温下加山葵过氧化物酶连接二抗孵育1h，使用ECL（Millipore，MA，USA）观察。β－actin（1∶5000，Abcam）作为内参。

1.8 统计学处理

采用SSPS12.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，应用统计方法t检验，P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 RhoBTB1是 microRNA－31的靶蛋白

由于miRNA的调控目标基因mRNA的翻译和凋亡是通过和靶基因3＇UTR的直接结合而相互作用，我们试图寻找miR－31的靶基因，以进一步揭示其结肠癌发生机制中的影响。通过使用miRNA靶基因预测的数据库（http：／／www.targetscan.org），我们假定 RhoBTB1为 miR－31的靶基因（图1A）。研究RhoBTB1是否为miR－31的直接靶基因，我们应用了荧光素酶报告基因检测。

首先，我们构建了荧光素酶报告质粒包含RhoBTB1 3＇UTR序列（WT－RhoBTB1）或删除预测的 miR－31的靶基因位点（mut－RhoBTB1）。如显示在图1B后，共同转染的wt－RhoBTB1质粒，与对照miR转染的细胞，miR－31转染的细胞的荧光素酶活性的显著减少，而与mut－RhoBTB1质粒共同转染的细胞荧光素酶的活性没有改变。两者合计，这些结果表明了miR－31针 对3＇UTR直接调控RhoBTB1。

图1 A 靶基因预测数据库中miR－31靶基因的预测结果

图1 B miR－31转染HT－29细胞后，荧光素酶的检测结果

2.2 miR－31的下调RhoBTB1在HT29细胞中的表达

RhoBTB是Rho家族小分子鸟苷酸三磷酸酶，由3名成员组成，有报道称两名成员RhoBTB1和RhoBTB2为抑癌基因。我们发现RhoBTB1为人结肠癌细胞系HT29中miR－31的靶蛋白，接下来我们研究miR－31对RhoBTB1表达的影响。与转染对照RNA的 HT29细胞相比，转染miR－31mimics HT29细胞的RhoBTB1mRNA表达水平显著下调（图2A），western－blotting结果显示miR－31表达抑制之后RhoBTB1蛋白表达水平上调（图2B）。在结肠癌组织中miR－31的上调抑制RhoBTB1的表达。

图2 A miR－31mimics转染HT－29细胞，RhoBTB1的mRNA表达水平比较

图2 B miR－31mimics转染HT－29细胞，RhoBTB1的蛋白表达水平比较

3 讨论

miRNA是内源性表达的小非编码RNA，它控制目标信使RNA基因的表达。据估计，在人类，基因编码的miRNA的数量约3%，这可能调节30%蛋白质的编码基因［12，13］。确实的证据说明，miRNA人类癌组织中表达异常，在肿瘤的发生和发展中发挥着重要作用［14，15］。

为了确定 miR－31的靶基因，我们使用TargetScan sorftware，分析结果表明，肿瘤抑癌基因RhoBTB1的可能是miR－31的靶基因。RhoBTB1属于RhoBTB亚家族。RhoBTB蛋白是Rho家族小分子鸟苷酸三磷酸酶的非典型成员。Rho GTP酶作为分子开关调节肌动蛋白，被认为是细胞骨架重构的主要调节分子，越来越多的证据表明，他们也参与调节细胞周期和细胞凋亡，也有报道称Rho GTP酶参与肿瘤的发展［16－18］。

RhoBTB亚家族被证实是在2001年在真核细胞盘基网柄菌的基因编码Rho－相关蛋白的研究中。和其他典型的RhoGTPases不同，RhoBTB蛋白质不是调节肌动蛋白系统。现在，RhoBTB的家族两名成员，RhoBTB2和RhoBTB1，被认为是肿瘤抑制蛋白。RhoBTB1，位于10q21，在（HNSCC）的发展有一定的作用。

我们的研究表明，抑癌蛋白RhoBTB1是miR－31的靶蛋白。microRNA－31能够下调RhoBTB1在HT29细胞中的表达量。miRNA－31在调控肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。对miRNA的深入研究无疑能增进对大肠癌发生、发展、转归等机制的认识，促进诊断和治疗的快速发展。阐明大肠癌相关miRNA的作用机制将可能丰富大肠癌的病因学及分子病理学理论，为大肠癌诊断治疗提供新策略和思路。如能根据此研究研制出抗肿瘤新药，给社会及经济方面带来深远的影响。

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