重组人脑利钠肽对动脉硬化大鼠血管内皮功能的影响

周 琳，张 静，袁天阳，李扬雪，徐艳玲，戴 琎

（吉林大学第二医院 心血管内科，吉林 长春130041）

动脉粥样硬化（AS）其主要病变特点是动脉病变从血管内膜开始，局部有脂质和复合糖类聚集，出血和血栓形成，纤维组织增生和钙盐沉积，并有中层的逐渐退化及钙化。但其发病机制尚无定论，目前较为接受的学说是血管内皮细胞损伤的反应假说。当内皮功能障碍时可导致血管收缩、血栓形成、内膜增生等。因此保护血管内皮功能成为治疗动脉粥样硬化的新趋势。

1 材料与方法

1.1 材料

40只健康Wistar大鼠购自吉林大学白求恩医学部实验动物中心。重组人脑利钠肽 （新活素），由成都诺迪康生物制药有限公司提供，单硝酸异山梨酯（华仁欣舒），由青岛华仁药业提供，阿魏酸钠（海斯），由晋城海斯制药有限公司提供。高脂饲料（普通面料88.8%，由吉林大学公共卫生学院提供；猪油10%，由吉林大学公共卫生学院提供；胆固醇1%，由沈阳试剂五厂提供；猪胆盐0.2%，由中国惠氏生化试剂有限公司提供）。

1.2 方法

1.2.1 动脉粥样硬化模型的建立和动物分组 40只健康 Wistar大鼠，均为雄性，体重为（220±10）g，实验室保持室内安静，饲养温度（22±2）℃，相对湿度40%－50%，通风良好，自然光照，光－暗周期12 h，自由进普通饲料、水，实验前适应1周后按体重质量随机分成5组，对照组、模型组、硝酸酯处理组、阿魏酸钠处理组及新活素处理组各8只。除对照组继续喂养普通饲料外，余4组给予维生素D3灌胃（按5×105U／kg的总量分3天灌胃），其后饲以高脂饮食。实验周期为12周。

1.2.2 给药途径 硝酸酯处理组：给予皮下注射单硝酸异山梨酯3mg／kg每日一次，阿魏酸钠处理组：给药剂量（mg／kg）＝W×人注射剂量（mg／kg）。（人静点阿魏酸钠剂量按400mg／60kg／d，W为折算系数取6.25），每日皮下注射一次。新活素处理组：给予rhBNP 0.1mg／kg每日一次皮下注射。对照组，模型组均给予等剂量的生理盐水。

1.2.3 生化指标测定 采用全自动生化分析仪测定血清总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL－C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL－C）水平。

1.2.4 TXB2、6－Keto－PGF1a的测定 5组分别在处理前及处理后抽血4ml，3 500r／min离心15 min，分离出血清，－80℃冰箱保存。所有标本与收集后统一检测。分别采用酶联免疫法（ELISA）检测各组用药前后血清中 TXB2、6－Keto－PGF1a浓度。

1.2.5 主动脉切片的制备 用乙醚麻醉动物，心脏取血后，立即取完整主动脉（从主动脉根部至髂总动脉分叉处），经10%甲醛溶液固定后，常规石蜡包埋，切片二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗，苏木紫染色5min，盐酸乙醇化30s，自来水浸泡15min后，置伊红液2min，常规脱水、透明、封片。

1.2.6 统计学方法 所有数据均采用SPSS11.0统计软件进行统计分析。各组参数用±s表示，同组药物处理前后比较采用配对样本均数的t检验。检验水准α＝0.05，P＞0.05差异无统计学意义，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体重的变化（表1）：12周后，高脂饲料组与对照组比较体重有明显差异P＜0.05。

表1 各组间大鼠体重的比较（±s）（单位：g）

表1 各组间大鼠体重的比较（±s）（单位：g）

注：＊各组与对照组比较无明显差异，P＞0.05；#各组与对照组比较有显著性差异，P＜0.05

n第1周 第4周 第8周 第12周18模型组 8 244.50±6.0＊ 384.1±8.37# 423.0±6.87# 455.0±13.8#硝酸酯组 8 247.50±9.0＊ 385.0±4.08# 427.5±6.29# 460.0±12.9#阿魏酸钠组 8 247.23±10.53＊ 387.5±6.92# 431.6±7.45# 461.0±12.1#新活素组 8 247.00±13.52＊ 388.3±7.45# 430.0±6.45# 458.0±15.7对照组 8 243.10±8.8 363.3±7.08 393.0±5.77 413.0±7.#

2.2 各组血脂及相关成分的浓度的变化（表2）：高脂饮食组血脂水平明显高于对照组（P＜0.05），各处理组之间血脂水平未见明显差异（P＞0.05）。

表2 各组间大鼠血脂及相关指标的结果（±s）（mmol／L）

表2 各组间大鼠血脂及相关指标的结果（±s）（mmol／L）

注：#各组与对照组比较有显著差异，P＜0.05；＊处理组之间比较未见明显改变，P＞0.05

8 3.6±0.42 1.68±0.18 2.02±0.05 2.84±0.23模型组 8 13.0±0.47# 5.89±0.40# 1.39±0.26# 3.92±0.18#硝酸酯组 8 13.7±0.92#＊ 5.92±0.29#＊ 1.39±0.21#＊ 3.93±0.10#＊阿魏酸钠组 8 14.3±0.72#＊ 5.93±0.20#＊ 1.34±0.15#＊ 3.92±0.16#＊新活素组 8 14.4±0.46#＊ 5.94±0.16#＊ 1.41±0.16#＊ 3.93±0.14#＊TC TG HDL－C LDL－C对照组n

2.3 大鼠主动脉形态学变化

2.3.1 肉眼观察情况

对照组血管弹性较好，内膜光滑，富有光泽。高脂组：动脉弹性减低，管壁增厚，内膜光泽度较对照组差。各处理组之间肉眼观察较模型组无明显改变。

2.3.2 光镜观察结果 光镜观察提示（×100倍）：对照组中大鼠主动脉内膜血管内皮排列有序，未见异常改变。模型组中大鼠主动脉血管壁局部形成粥样斑块向管腔内突出，引起管腔狭窄，斑块由泡沫细胞和胆固醇结晶构成，弹力纤维断裂，动脉外膜变薄，呈现较典型的动脉粥样硬化改变。光镜观察提示（×200倍）：对照组主动脉EC排列有序，无明显改变。模型组中可见血管内膜不光滑，局部可见泡沫细胞和胆固醇结晶。

进一步放大（×400倍）观察提示：对照组动脉内膜光滑，EC排列整齐有序、无缺失，内膜下间隙较小；模型组血管壁增厚，内膜不光滑，排列紊乱，EC成连续性缺失，底层胶原纤维暴露，大量MC粘附于内皮表面或潜入内皮下，内皮下间隙增宽；处理组内膜较光滑，局部有少量MC粘附，可见EC缺失，但好于模型组，处理组之间未见明显差别。（见图1－12）

图1 模型组主动脉组织HE染色×100

图2 正常对照组主动脉组织HE染色×100

图3 模型组主动脉组织HE×200

图4 正常对照组主动脉组织HE×200

图5 硝酸酯处理组主动脉组织HE×200

图6 阿魏酸钠处理组主动脉组织HE×200

图7 新活素处理组主动脉组织HE×200

图8 模型组主动脉组织HE×400

图9 正常对照组主动脉组织HE×400

图10 硝酸酯处理组主动脉组织HE×400

图11 阿魏酸钠处理组主动脉组织HE×400

图12 新活素处理组主动脉组织HE×400

2.4 处理组前后TXB2和6－Keto－PGF1a变化的比较（±s）

处理组在处理前的TXB2和6－Keto－PGF1a之间组间比较，差别无统计学意义（P＞0.05），但是其与对照组比较，差别有统计学意义（P＜0.05）。各处理组治疗前后TXB2和6－Keto－PGF1a比较差异有统计学意义（P＜0.05），处理后好于处理前。见表3。

表3 处理前后大鼠TXB2和6－Keto－PGF1a变化的比较（±s）

表3 处理前后大鼠TXB2和6－Keto－PGF1a变化的比较（±s）

注：＊各组处理前比较无统计学差异P＞0.05，# 每组与处理前比较有统计学差异（P＜0.05）

TXB 2 6－Keto－PGF1 n α 8 100.5±3.77 100.4±3.36 61.6±3.35 61.8±2.32模型组 8 150.5±3.98＊ 152.6±3.94 48.7±1.93＊ 49.4±1.40#硝酸酯组 8 150.5±2.62＊ 136.2±2.0# 47.7±2.24＊ 63.0±2.23#阿魏酸钠组 8 150.4±4.74＊ 123.7±1.5# 50.1±2.41＊ 72.89±2.09#新活素组 8 151.5±5.31＊ 114.0±1.7# 50.41±2.28＊ 83.61±1.30处理前 处理后对照组处理前 处理后#

2.5 不同药物对TXB2、6－Keto－PGF1a处理后结果的比较（±s）

硝酸酯类、阿魏酸钠、新活素处理后TXB2、6－Keto－PGF1a在各组略有不同，新活素组不劣于硝酸酯组及阿魏酸钠组，但无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

从本研究结果得到：rhBNP提高动脉粥样硬化大鼠血清中PGI2的含量，降低TXA2的含量，并且在形态上改善动脉粥样硬化大鼠的血管内皮功能。

正常情况下，血管内皮细胞是一种具有选择性的通透膜，具有促进分子之间的交换的功能，是血液与组织的一道天然屏障。它同时具有感受器及效应器功能，又是人体最大，功能活跃的内分泌，旁分泌及自分泌代谢器官，产生和分泌多种生物活性物质［1］，对血管的张力、生长、脂质代谢等方面起着调控作用。而PGI2／TXA2的平衡是维持内皮细胞完整的重要环节也是维持血小板正常形态和血液凝固的重要机制。在长期血脂紊乱情况下，增高的脂蛋白尤其是极低密度脂蛋白和胆固醇对动脉内膜产生功能性损伤，使单核细胞聚集、各种炎性因子分泌增多，进而促进结缔组织增生、平滑肌细胞增殖。循环血液中的血小板就可粘附在损伤部位，致使TXA2合成增加，而PGI2合成减少，从而导致PGI2／TXA2平衡失调。正因为如此，如何应用药物干预PGI2／TXA2的平衡将成为治疗动脉粥样硬化的新靶点。本研究分别应用硝酸酯、阿魏酸钠及rhBNP观察TXB2和6－Keto－PGF1a的变化旨在揭示不同药物对PGI2／TXA2系统的影响，探讨新活素改善内皮功能的机制。

rhBNP是利用基因工程技术合成的与BNP生物作用完全相同的重组产物，其在心力衰竭中的应用已得到广泛认可。目前已有文献表明了rhBNP在冠心病中的应用。已有研究表明张桂娟研究表明PGI2的含量与冠状动脉病变支数成反比，动脉硬化越严重，PGI2合成越少，提示冠心病患者存在血管内皮细胞分泌血管活性物质的平衡失调［2］。魏庆民等关于rhBNP对猪急性心肌梗死患者PCI术后心室重塑和心室收缩同步性影响的研究证明rhBNP对急性心肌梗死的治疗有效，无副作用［3］。美国加州大学旧金山医学中心通过冠脉造影及冠脉内超声（IVUS），观察应用rhBNP治疗ACS患者对冠状动脉血管的影响，发现静脉给药30min，冠脉动脉血管明显扩张，心肌耗氧量下降8%，提示rhBNP对ACS患者有治疗益处［4］。王智慧等应用rhBNP治疗44例急性冠脉综合征患者临床观察中，在常规药物治疗的基础上加用rhBNP后发现治疗前后血清中NO及ET－1的含量差值较对照组患者血清中NO及ET－1的含量差值变化明显［5］。

给予硝酸酯、阿魏酸钠、rhBNP等药物治疗后，TXB2及6－Keto－PGF1a与处理前比较有差异（P＜0.05），二者趋于正常平衡。各处理组之间的比较无明显差异，但新活素处理组不劣与硝酸酯、阿魏酸钠组。本实验发现重组人脑利钠肽（新活素）对大鼠动脉粥样硬化病变血液中PGI2、TXA2有影响，rhBNP改善血管内皮功能可能是通过维持PGI2－TXA2的稳定来发挥作用的。本实验提示了rhBNP不仅作为治疗急性失代偿性心衰的药物，在治疗动脉粥样硬化中也发挥重要作用。

［1］Anderson TJ.Asseement and treatment of endothelium dysfuction in humans［J］.Am coll cardiol，1999，34：631.

［2］张桂娟，赵 颂，张香梅 .冠心病患者血浆中内皮素和前列腺素变化的临床意义及其与冠状动脉病变支数的关系［J］.中国综合临床，2002，18（5）：419.

［3］魏庆民，等.静脉应用重组人脑利钠肽对急性心肌梗死经皮冠状动脉介入治疗后患者心室重塑和左心功能的影响［J］.中国全科医学杂志，2007，10（8）：615.

［4］Andrew D.Effects of intravenous nesiritide on human coronary Vasomotor regulation and myocardial oxygen uptake［J］.Circulation，2003，107：2697.

［5］王智慧.重组人脑利钠肽对急性冠脉综合征患者内皮功能相关因子的影响［D］.长春：吉林大学第二医院，2010.