苯乙酸联合5－氟尿嘧啶、顺铂对喉癌细胞株凋亡的影响及在荷瘤鼠动物模型中的作用观察

吴志圣，赵 明，金春顺，陈 鸥

（吉林大学第二医院 耳鼻喉头颈外科，吉林 长春130041）

苯乙酸（phenylacetate acid，PA）是正常生物体中苯丙氨酸脱氨基的代谢产物，目前的文献［1－3］表明，PA可以在体内和体外抑制多种肿瘤细胞的生长和增殖。临床证明单一用药苯乙酸往往不能根治肿瘤，停药后肿瘤容易复发，故国内外的学者均主张联合化疗加放疗治疗以提高疗效。我们采用苯乙酸联合应用5－Fu、CDDP作用于喉癌细胞，应用流式细胞仪、荷瘤鼠模型等方法，观察联合用药组与单一药物组对喉癌细胞凋亡作用，并制作荷瘤鼠模型进行动物体内实验。初步探讨苯乙酸是否可以增强化疗对喉癌细胞的凋亡作用，是否可以减少化疗的毒副作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人喉癌细胞株Hep－2购自中科院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所。苯乙酸（PA）由北京长城化学试剂公司由吉林省应化物理所提供。RPMI－1640人工合成培养液购自GIBCO。胎牛血清为Hyclone公司产品。5－Fu及顺铂购于江苏豪森药业股份有限公司。EM－1200EX型透射电子显微镜为日本产品。LKB－Ⅲ型超薄切片机为瑞典产品。流式细胞仪Becton Dickinson产自美国。荷鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。鼠黑色素瘤细胞B16购自中科院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所。统计学分析：采用SPSS奖惩10.0软件进行方差分析和t检验。

1.2 方法

1.2.1 流式细胞仪的检测 流式细胞仪检测Hep－2细胞周期各时相的变化及细胞凋亡率。

1.2.2 取对数生长期的人喉癌细胞株 Hep－2细胞，用0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞后制备成单细胞悬液，细胞培养，培养结束后收集细胞。

1.2.3 以900rpam／min离心，5min，PBS洗两次；

1.2.4 70%乙醇重悬细胞，并使之固定12h以上；

1.2.5 取96孔培养板，每2孔为一组，每孔加入准备的Hep－2细胞2×104／孔，每孔按预实验得到最佳抑瘤作用剂量加入不同浓度的PA、5－Fu和顺铂：PA 浓度20mg，5－Fu 20mg，CDDP 8mg，PA＋5－Fu＼20mg＋20mg，PA＋CDDP＼20mg＋8mg，并设对照组。于37℃5%CO2培养箱内培养，分别在24h终止培养。PBS洗两次，调细胞浓度为1×106个／ml，RNAase消化后，加入 1.5ml PI（碘化丙啶5 mg／100ml）染色1h，过4S目网，上机检测，混匀后上流式细胞仪做单参数分析，每份样品检测1×104个细胞。GI峰前面出现的亚2倍体峰即为凋亡峰。

1.3 荷瘤鼠动物模型的建立及分组治疗

1.3.1 鼠黑色素瘤细胞复苏、培养、冻存方法。C57BL／6小鼠荷B16肿瘤模型的建立及分组治疗。

1.3.2 鼠C57BL／6，雄性鼠30只，6－8周龄，体重18g。

1.3.3 方法 取对数生长期的鼠黑色素瘤B16细胞，用无血清 Hank’s洗涤2次后，调整细胞浓度为4×106个／ml，于鼠左后肢皮下注射鼠黑色素瘤B16细胞0.5ml（含细胞2×106），于接种的第5天将荷瘤鼠随机分为6组，每组5只。第一组：单纯给PA组，第二组：单纯CDDP组，第三组：单纯5－Fu组，第四组：PA＋CDDP组，第五组：PA＋5－Fu组，第六组：生理盐水对照组。每只鼠接种PA均右侧皮下给药，注射量为0.5ml，浓度20μg／日。5－Fu及顺铂为胃肠给药，5－Fu 20μg／日，顺铂：6mg／日，每日给药一次，连续5天后停一天给药，共计给药14日，将鼠处死，测量瘤鼠左下肢肿瘤大小及重量，并作病理形态学观察。

2 结果

2.1 流式细胞仪检测

流式细胞仪检测结果表明，分别用PA、5－Fu、CDDP及 PA＋5－Fu、PA＋CDDP作用 Hep－2细胞24h后，出现了凋亡峰，即流式细胞仪分析PI染色后低于G0／G1期出现的亚二倍体峰。结果显示，PA增强5－Fu、CDDP对Hep－2的细胞的凋亡作用，对CDDP的作用更为显著，与单一用药组比具有显著差异性，P＜0.05，药物作用后细胞各时相变化及凋亡率与对照组比较差异非常显著，P＜0.01，并且呈剂量依赖性增加，而对照组未见或仅见较低的二倍体峰（图1－5）。

图1 PA 20mg凋亡率3.9%

图2 5－Fu 20mg凋亡率2.59%

图3 CDDP 8mg凋亡率5.61%

图4 PA＋5－Fu／20mg＋20mg凋亡率5.30%

图5 PA＋CDDP／20mg ＋8mg凋亡率9.83%

2.2 荷瘤鼠联合用药状况

2.2.1 在给药后7日内各组小鼠反应灵敏，毛顺，色泽光滑，饮食正常，体重增长较快，各组小鼠体重增长无显著差异。自实验第8日起，5－Fu、CDDP组鼠出现厌食、倦缩懒动，体重增长减慢，对照组至实验结束出现全身重量减轻，瘤体增长快，鼠一般状态欠佳，怠倦。PA＋5－Fu及PA＋CDDP组出现上述症状时间晚，于给药半个月后才出现上述症状，且症状轻，以PA组鼠状态最好。从生存率看鼠实验中共计死亡4只：5－Fu组2只，CDDP组1只，PA＋5－Fu组1只。5－Fu组于用药第8天给药时，死亡1只，在给药第14天不明原因死亡1只，CDDP组，于第15天不明原因死亡1只；PA＋5－Fu组注射第7天1只鼠出现颈部皮下气肿，于次日死亡，从实验结果看，5－Fu组、CDDP组鼠死亡较高，而联合用药组、PA组鼠生存时间较长。

2.2.2 测鼠体重开始14天内，测量各组鼠体重无明显变化。14天后，肿瘤对照组随着瘤体迅速增大，体重增加较明显。但25天后，鼠体重减轻，单一化疗用药组，实验前期，鼠体重增长较对照组比显著差异。实验后期，鼠体重明显减轻，呈衰竭状态，鼠死亡较多。联合用药组PA＋5－Fu、PA＋CDDP组，鼠体重略减轻。鼠瘤体大小测量显示，对照组瘤体增长较大，而PA＋CDDP组，瘤体变小，（表1）测量瘤体重结果对照组与联合用药组PA＋CDDP组比，差异具有显著性。

2.2.3 肿瘤病理形态学观察HE染色显示，PA组无病变，而5－Fu组一只鼠有肺部炎症改变且较重；PA＋CDDP组，一只鼠也有炎症改变，但较轻，（图6、图7）。瘤体HE染色显示对照组瘤细胞生长结构完整，细胞形态良好，而联合用药组瘤体内细胞有较多坏死灶（图8、图9），说明联合用药组对瘤体产生了抑制杀伤作用。

表1 PA、CDDP、5－Fu及联合用药组15天的瘤体重 ±s／g

表1 PA、CDDP、5－Fu及联合用药组15天的瘤体重 ±s／g

＊＊P＜0.01 ＊P＜0.05

分组n¯x±s 5 2.81±0.53 CDDP组 4 2.46±0.36 5－Fu组 3 2.83±0.42 PA＋CDDP组 5 2.09±0.71＊＊PA＋5－Fu组 4 2.33±0.51＊对照组PA组5 3.12±0.24

图6 荷瘤鼠PA组、肺组织无病变 光镜200×

图7 5Fu组荷瘤鼠肺组织炎症细胞浸润，肺泡间隔增厚、塌陷、光镜200×

图8 对照组大部分细胞形态良好，结构完整 光镜200×

图9 PA＋CDDP组肿瘤细胞可见坏死灶 光镜200×

表结果表明，PA 联合CDDP及5－Fu后，对B16荷瘤小鼠抑癌作用与对照组相比，差异显著，而单一用药组与对照组相比虽然无统计学意义，但瘤体重量有减轻趋势。

3 讨论

本实验流式细胞仪细胞周期分析表明：PA、5－Fu、CDDP、PA＋5－Fu、PA＋CDDP，对 Hep－2细胞周期均有影响，即将 Hep－2细胞周期阻滞于G1期［4－7］，G1期细胞增多，同时伴S期细胞减少［8］。使G2／M期细胞减少，细胞凋亡率上升。肿瘤细胞可分为增殖细胞与非增殖细胞两种：增殖细胞与肿瘤生长直接有关，对抗肿瘤较敏感，是化疗重要攻击目标。而PA作用下使这种作用产生了协同增强效应，故PA＋5－Fu或PA＋CDDP化疗药物的疗效比较单一5－Fu以及CDDP作用明显增强。

胡国华［9］等用嗜银蛋白检测技术预测头颈肿瘤化疗药物的敏感性，共59例，喉鳞癌38例，喉咽鳞癌2例，鼻咽鳞癌16例，鼻腔恶性淋巴瘤2例，耳廓鳞癌1例，均经病理证实。实验所测得的敏感药物顺序大致与临床结果符合，其敏感性较好的药物如：CDDP、VCR（长春新碱）与5Fu，PYM（平阳霉素）等是目前头颈肿瘤化疗中首选，这与我们实验结果相符合，同样在PA作用下，以CDDP对PA的作用更为敏感，说明在头颈肿瘤化疗治疗应以CDDP为基础。PA增强化疗药CDDP对喉癌细胞珠Hep－2凋亡途径［10］。

5－Fu、CDDP是临床上常用的化疗药物，具有较强的抑瘤作用，但作为一种免疫抑制剂，临床应用时毒副作用较大。在荷瘤鼠B16动物模型治疗研究中，采用了胃肠给药及健侧皮下给药方式，可以排除PA及5－Fu、CDDP局部用药而对肿瘤所产生的直接毒性作用。从一般状态上及病理上观察，研究结果表明联合给药组小鼠肿瘤受到抑制，其中以PA＋CDDP组最明显，瘤体体积缩小明显，PA联合CDDP及5－Fu后，对B16荷瘤小鼠抑癌作用与对照组相比，差异显著。说明荷瘤鼠对5－Fu、CDDP不耐受，可能与化疗毒副作用有关。分析5－Fu、CDDP两组，不明显原因死亡的荷瘤鼠，可能和化疗药物的毒性作用及并发症有关。实验表明PA在动物体内无毒副作用或者毒副作用很低，动物对其有很好的耐受。

肿瘤生物化学疗法（Biochemotherapy）是生物治疗和化学治疗联合应用于肿瘤的全新综合治疗模式，但是化疗一般多为细胞毒药物，靶向性不强，在杀伤肿瘤细胞的同时明显影响患者造血、免疫和某些器官（系统）的功能，易产生多药耐药而失败。化疗和生物治疗的联合往往可以起到相加或协同治疗的作用。

本实验说明苯乙酸和5－Fu、CDDP化疗药物联合应用可以明显增强对 Hep－2细胞生长增殖抑制作用，促进细胞形态转化，显著提高促凋亡作用。荷瘤鼠动物模型治疗，PA＋CDDP组与PA＋5－Fu联合用药组肿瘤体积缩小，具有显著性，瘤体抑癌率较单一用药组明显提高，化疗药物的毒副作用于苯乙酸联合应用后可以减轻，荷瘤鼠治疗的实验为喉癌化疗治疗提供了新的思路。并且减少化疗药物剂量及减少耐药性，减轻毒副作用及并发症的发生，为喉癌临床治疗提供了理论基础。

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