Ezrin影响胶质瘤在裸鼠脑内的浸润性生长

刘乃杰，方 威，赵丛海，秦治刚，金星一，孙利波，房晓萱

（吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130033）

脑胶质瘤是最常见的、致死的神经系统肿瘤，约占CNS恶性肿瘤的80%。最普遍的和侵袭性最强的神经胶质瘤是第四级神经胶质瘤（多形性胶质母细胞瘤（GBM）），恶性度高，且耐化疗［1］。尽管有最佳的临床治疗，但神经胶质瘤的预后极差，平均生存期为12到15个月［2－4］。原因是神经胶质瘤呈弥漫性生长，肿瘤细胞浸润周围正常的脑组织。因此，外科手术很难切除，残余的肿瘤导致复发。据报道Ezrin基因是横纹肌肉瘤（RMS）和骨肉瘤转移的关键因子［5］，其高表达可促进乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、前列腺癌和骨肉瘤等肿瘤的转移［5－10］。另据报道，Ezrin在脑胶质瘤的表达上调［11，12］，但与脑胶质瘤浸润性生长的机制的关系不清楚。因此，本文对脑胶质瘤细胞U87的Ezrin沉默或过表达，观察其在裸鼠脑内的迁移及浸润生长情况，探索脑胶质瘤生长特点的机制，为治疗寻找新的靶点。

1 材料和方法

1.1 材料

EcoRⅠ、XhoⅠ，DNA Ligation Kit Ver.2.0，pMD○R18－T Vector，Ribonuclease Inhibitor，TaKa－Ra LA Taq○RHot Start Version，Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0，DL2，000DNA Marker、DL10，000DNA marker，大肠杆菌感受态细胞DH5α，宝生物工程（大连）有限公司；限制性内切酶BbsⅠ、BamHⅠ、PstⅠ，λDNA／Eco130l，MBI Fermentas公司；pGPU6／GFP／Neo载体，上海吉玛制药技术有限公司；M－MLV反转录酶，Promega；质粒小量提取试剂盒，杭州爱思进生物技术有限公司；低分子量蛋白 marker（16－105kD），北京鼎国生物技术有限公司；TRIzol，脂质体 LipofectimineTM2000，Invitrogen公司。抗人Ezrin抗体，Cell Signaling Technology公司；HRP标记二抗IgG，DAB显色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司。DMEM培养基，Life Technologies；小牛血清，Hyclon；引物、测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。人胶质瘤细胞株U87，购自中国科学院细胞库。BALB／c裸鼠购于北京华阜康生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 构建Ezrin基因shRNA载体并筛选有效的iRNA 根据GenBank登录的Ezrin基因，应用Designer3.0（Genepharma）软件设计4个不同位点的shRNA DNA oligo，合成并克隆至shRNA载体pGPU6／GFP／Neo载体，转化后，小量提取质粒，经BamHⅠ、PstⅠ酶切及测序鉴定后，以脂质体LipofectimineTM2000介导分别转染U87细胞，详细过程按说明书操作。转染后48h荧光显微镜下观察转染情况，收集转染细胞，RT－PCR及Western blot检测Ezrin表达量的变化。Ezrin检测引物EF2：5’－TCGACAAGAAGGCACCTGAC－3’，ER2：5’－CTGTCTCTCCAGCTCCTCCT－3’，扩增产物420bp。

1.2.2 Ezrin基因表达载体的构建及鉴定

1.2.3 应用裸鼠脑瘤模型检测Ezrin基因沉默及过表达对U87细胞浸润性生长的影响的影响

0.25%胰酶消化转染基因的U87细胞，PBS洗涤，计数、备用。裸鼠以4%水合氯醛（400mg／kg体量）腹腔麻醉后，固定于立体定位仪。常规消毒、铺巾，确定进针位置：前卤门前1mm，矢状缝右侧1.8mm处，深度3.5mm，用10μl微量进样器吸取5μl U87细胞悬液（1×108／ml），缓慢注入裸鼠脑尾状核内，注射后留针10min。每天观察并记录裸鼠状态。21天后处死，解剖，剥离脑组织，冰冻切片，激光共聚焦显微镜下观察肿瘤细胞的生长情况。

2 结果

2.1 构建Ezrin基因shRNA载体并筛选有效的iRNA

2.1.1 酶切鉴定Ezrin基因shRNA重组质粒

将合成的Ezrin shRNA的Oligo DNA退火后克隆至pGPU6／GFP／Neo载体，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α后，提取质粒，BamHⅠ、PstⅠ分别酶切，如图1，被BamHⅠ切开的、不能被PstⅠ切开的为阳性重组质粒。选取2个质粒测序。

图1 BamHⅠ、PstⅠ酶切鉴定Ezrin基因shRNA重组质粒

2.1.2 Ezrin基因shRNA重组质粒测序及分析

每个克隆载体选取2个质粒测序，并应用NCBI网站的 Align two（or more）sequences using BLAST（bl2seq）对所测得的序列与理论序列进行比对分析，分析结果显示所测序列与理论序列完全一致，表明克隆的Ezrin shRNA oligo DNA是正确的（图2）。

图2 Ezrin基因shRNA重组质粒序列分析

2.1.3 有效Ezrin shRNA载体筛选 Ezrin shRNA载体以脂质体LipofectimineTM2000介导转染U87细胞，48h后，收集细胞，提取细胞RNA和蛋白，RT－PCR检测Ezrin mRNA的表达，显示shR－NA－Ezrin－2转染组细胞其表达量降低，如图3。Western blot 检 测 显 示 shRNA－Ezrin－2 转 染 组Ezrin蛋白的量降低，如图4。因此shRNA－Ezrin－2为有效干扰载体。

图3 RT－PCR鉴定Ezrin mRNA在shRNA载体转染的细胞的表达

图4 Western blot鉴定Ezrin蛋白在shRNA转染细胞的表达

2.2 裸鼠脑瘤模型检测Ezrin基因沉默及过表达对U87细胞浸润性生长的影响

裸鼠脑注射转基因的U87细胞21天，处死、解剖，剥离出脑组织，冰冻切片后，激光共聚焦显微镜下观察可见，与对照组对比，shRNA－Ezrin－2转染组迁移细胞数少，而pEGFP－C1／Ezrin转染组迁移细胞相对较多（图5），表明Ezrin基因沉默可阻断U87细胞浸润性生长，过表达可促进U87迁移，增强其浸润生长。

3 讨论

图5 Ezrin基因沉默及过表达对影响U87细胞在裸鼠脑内的浸润性生长

脑胶质瘤具有发病率高、死亡率高、复发率高等特点，是中枢神经系统疾病的难点［13，14］。手术切除和放射治疗（RT）辅以化疗是当前治疗标准，但神经胶质瘤对治疗抵抗，主要因素是神经胶质瘤具有弥漫性生长的天性，肿瘤细胞浸润邻近正常的脑组织，因此，外科切除术难以切除，残余的肿瘤无疑导致复发；神经胶质瘤高剂量的放射治疗受正常组织毒性影响大脑功能的限制；神经胶质瘤又因天然的血脑屏障（BBB）排斥化学疗法和其他有针对性的治疗方法使治疗效果较差。尽管神经影像学的发展和术中肿瘤示踪技术的应用使脑胶质瘤的治疗取得了一定的进展，但也难以保证以手术为主的治疗能完全根除肿瘤，其根本原因是脑胶质瘤的生长特点决定的。

肿瘤转移是恶性肿瘤的生物学特点，细胞运动能力增强导致其迁移和侵袭，细胞骨架的重塑是直接原因，而Ezrin作为肌动蛋白与细胞膜及膜表面受体连接的桥梁，在肿瘤侵袭转移过程中具有枢纽作用［15］。Bruce等［16］应用组织芯片检测了5000例标本包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌及正常组织的Ezrin的表达，结果显示Ezrin在肿瘤组织中呈高表达，且与肿瘤组织的分级及预后密切相关。在Kobel［17］的实验中164例FIGO分期Ⅰ期的子宫内膜癌，有93%Ezrin高表达，而且表达Ezrin的肿瘤细胞之间的连接比较松散。Khanna等［18，19］用cDNA微列阵技术检测发现，Ezrin在高侵袭性的K2M7肿瘤细胞中的表达量高于低侵袭性的K12肿瘤细胞3倍，Wan等［20］应用反义Ezrin或siRNA阻断Ezrin的表达，可显著减少K2M7骨肉瘤鼠的肺转移发生率。Ezrin使肿瘤细胞具有高转移活性的另一个例证［21］是将Ezrin基因转染转移能力较低的细胞系，可使其转移能力显著提高。Tynninen O［11］检测229例原发和复发性星形细胞瘤患者（WHO分级Ⅱ－Ⅳ）、113例少突胶质细胞瘤（Ⅱ－Ⅲ）和寡树突神经胶质性和星状神经胶质性胶质瘤（oligoastrocytomas）（Ⅱ－Ⅲ）患者Ezrin的表达，发现Ezrin在星形细胞瘤表达最强（P＝0.006），少突胶质细胞瘤Ezrin的表达也是阳性，并且随着肿瘤级别的增加其表达增加（P＜0.05）；Ezrin与星形细胞瘤和寡树突神经胶质性和星状神经胶质性胶质瘤（oligoastrocytomas）的恶性度相关（P＝0.001），周龙等［12］的研究也证实了这一点。

因此本文以Ezrin基因shRNA载体和过表达载体分别转染U87细胞，接种裸鼠脑组织。21天后取脑瘤模型鼠脑组织，冰冻切片，激光共聚焦显微镜下观察可见，与对照组对比，shRNA－Ezrin－2转染组迁移细胞数少，而pEGFP－C1／Ezrin转染组迁移细胞相对较多，表明Ezrin基因沉默可阻断U87细胞浸润性生长，过表达可促进U87迁移，增强其浸润生长。至于其体内生长特点的机制有待深入研究。

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