贵州9个少数民族线粒体DNA Region V及Y染色体DYS287位点多态性研究*

任凌雁，何 燕，张 婷，王婵娟，官志忠，单可人

(贵阳医学院分子生物学重点实验室，贵州贵阳 550004）

近年来，利用线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)和Y染色体多态位点对不同人群进行比较，从而使人类进化和群体遗传研究得到较大发展。人类mtDNA极少发生重组，有效群体小，能严格的执行母系遗传。单核甘酸多态性 (Single nucleotide polymorphism，SNP)是人类变异最常见的一种，由于其密度高，遗传稳定等特点，SNP被认为是第三代遗传标记而广泛应用［1］。mtDNA上COⅡ/tRNALys基因间的非编码区Ⅴ中存在一个9 bp序列 (CCCCCTCTA)缺失的多态位点［2］，研究显示不同地域人群mtDNA 9 bp缺失频率有很大差别，是检测人类群体多态性的主要标志之一。Y染色体是父系遗传，并且大部分不发生重组，是分析人类起源、迁徙的重要工具。其中Y染色体DYS287位点是一个应用广泛，具有较高研究价值的多态位点，检测其阳性率可以研究不同民族群体的遗传关系。贵州是一个多民族省份，世居少数民族达17个，本次研究就17个世居少数民族中的毛南族、畲族等9个民族作mtDNA Region V以及Y染色体DYS287位点的多态性检测，分析这9个民族群体的遗传多态性。

1 材料与方法

1.1 样本采集

根据知情同意原则，分别采集贵州平塘毛南族、麻江畲族、黔西仡佬族、麻江仫佬族、威宁回族、刚边壮族、黔西满族、石阡蒙古族、江口羌族各60份血液标本，采血对象均3代内无族外通婚，彼此间无亲缘关系男性，EDTA·K2抗凝。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 按照酚氯仿法提取外周血白细胞DNA，定量标化至100 ng/μL后于－20℃保存。

1.2.2 mtDNA Region V的扩增及序列测定 引物序列:F 5-ACTTTCACCGCTACACGA-3，R 5-ATTTAGTTGGGGCATTTC-3，PCR反应体系为 25 μL，包括:10 × PCR Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10 μmol/L上下游引物各0.4 μL，TaqDNA聚合酶0.4U(北京天根生化有限公司)，DNA模板100 ng。PCR循环参数为94℃ 5 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环，72℃ 5 min。扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶检测。序列测定交由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.2.3 Y染色体DYS287位点的扩增及琼脂糖凝胶电泳检测 YAP引物序列F:5’-CAG GGG AAG ATA AAG AAA TA-3’，R:5’-ACT GCT AAA AGG GGA TGG AT-3’，25 μL PCR反应体系组成为:10× PCR buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，4×dNTP(每种10 mmol/L)2 μL，引物各 0.5 μL，DNA聚合酶1.0U(北京天根生化有限公司)，模板DNA 100 ng。PCR循环条件:94℃变性40 s，51℃退火40 s，72℃延伸30 s，循环30次。PCR产物用w=2%琼脂糖凝胶电泳分离。

2 结果

2.1 mtDNA Region V缺失多态类型检测与分析

在PCR检测中未见非特异扩增，并且获得2种带型，即258(双拷贝9 bp型)和249 bp(9 bp缺失型)，结果见图1。扩增产物测序结果与相对应的剑桥序列一致，结果见图2。检测的9个民族(各60份):仡佬族、畲族、壮族、仫佬族、毛南族、蒙古族、回族、羌族、满族mtDNA 9 bp缺失个数分别为:16、15、11、8、6、5、4、3。

图3 贵州9个少数民族mtDNA Region V缺失频率比较Fig.3 The comparison of mtDNA Region V deletion in 9 ethnic groups of Guizhou

2.2 Y染色体DYS287多态类型

在PCR－琼脂糖凝胶电泳检测中，未见非特异扩增，获得2种带型，455 bp(YAP+)和150 bp(YAP－)见图4，即发现仡佬族、毛南族分别有12例、1例YAP+，其余民族均为YAP－。

图4 Y染色体DYS287位点PCR产物电泳结果Fig.4 The results of electrophoresis of PCR products of Y-chromosome DYS287 sites

3 讨论

3.1 贵州9个民族mtDNA的Region V区9 bp分布特点

mtDNA的Region V区是位于8272－8289核苷酸之间2个串联的重复序列，其中一个由于DNA复制过程中滑链错配而丢失。学者认为9 bp序列的缺失起源于亚洲并且是亚洲人群的特征［3］，并且其分布与种群、地域有关。就我国民族9 bp缺失频率分析，台湾汉族9 bp缺失频率高达40%［4］，均高于本次研究的9个民族，而广州汉族的缺失频率 (20.8%)［5］与本次研究的蒙古族、回族、羌族、满族相差较大;西北边的一些少数民族，如朝鲜族 (9.43%)、维吾尔族 (3.3%)、塔吉克族 (1.43%)、现代罗布人 (8.3%)［6－9］与本次研究的回族、羌族、满族、蒙古族的缺失频率相近，与仡佬族等相差较大。这与姚永刚得出的结论是一致的。

从贵州世居民族的支系划分来看，畲族据记载是属于瑶族的一个分支，壮族、仡佬族、仫佬族、毛南族来源于古老的百越部落，其中仡佬族是贵州特有的少数民族，自商周时期就有记载。而蒙古族、回族、羌族、满族则是属于北方部落的民族。本次研究发现，起源于百越、苗瑶支系的民族9bp缺失频率是高于北方起源的民族的。但是同为北方民族的西北蒙古族的缺失频率 (4%)［4］低于贵州蒙古族，而贵州的满族与辽宁的满族 (6.67%)［4］缺失频率相接近，究其原因可能是这些民族群体在迁徙过程中与其他群体发生基因融合造成的。

从中国民族的语系划分来看，壮语、仫佬语、毛南语、仡佬语属于壮侗语系;畲语属于苗瑶语系;蒙古语、满语属于阿尔泰语系;羌语属于汉藏语系;而回语属于印欧语系。本次研究中，壮族、仫佬族、毛南族、仡佬族9 bp缺失频率是接近的，畲族与苗瑶语系的苗族如雷山苗族 (25.27%)［10］的缺失频率也相近，但是同为阿尔泰语系的蒙古族与满族、同为汉藏语系的羌族与贵州汉族(11.43%)［4］的缺失频率较大，尽管差异没有达到显著水平。

3.2 贵州9个民族Y染色体DYS287多态类型分析

DYS287位点是位于Y染色体长臂q11的一个Alu序列插入多态，是Y染色体特异区的双等位基因位点，由于Alu插入事件在进化史中仅发生过一次，故YAP－被认为是祖先型［11］，可以用于鉴定稳定的遗传谱系关系。DYS287位点也是具有地理、种群分布的特异性，不同地区或者不同民族其DYS287位点的YAP+频率不同。在我国藏族人群的 YAP+频率为 41.5%［12］，普米族更是高达72.3%［13］，均远高于本次研究。不同地区的同一个民族其YAP+表现也是有差异的，如蒙古族、回族。内蒙古的蒙古族和甘肃回族YAP+频率分别为4.3%［13］、3.23%［14］，而云南和贵州的蒙古族和回族 YAP+频率均为0。

从民族起源来看，属于北方部落的蒙古族、回族、羌族、满族，他们中回族和满族在其主要居住地发现YAP+，但是可能在迁徙过程中YAP+被稀释以致于迁徙到贵州的民族群体中没有发现YAP+;同属百越系统的壮族、仡佬族、仫佬族、毛南族中，本次研究发现了仡佬族和毛南族携带YAP+，其余民族 YAP+均为零，分析其原因可能是仡佬族和毛南族作为一个独立的群体与当时迁入的南方的汉族群体发生了基因交流所致，而其他百越系统的民族群体由于其古代部落没有携带YAP+，加上地理环境与周围隔绝造成了奠基者效应。从语言学分类上看，蒙古族、满族的YAP+携带率与同属阿尔泰语系的鄂伦春族［15］、哈萨克族的频率一样均为零;毛南族和仫佬族都属于壮侗语系侗水语支，其亲缘关系应该很近，本次研究中毛南族 YAP+的频率为1.67%，仫佬族未发现YAP+，可能是由于实验中抽样误差所致。畲族虽然与苗族同属苗瑶语系，但是各自的YAP+携带率是有较大差异的，苗族 YAP+频率为11.8%［13］，畲族为零，推测由于奠基者效应在本次研究的畲族群体中起到了作用。

总之，通过本次实验，获得了贵州9个世居少数民族mtDNA Region V以及Y染色体DYS287位点多态型数据，为我省少数民族的起源及迁徙提供了一定的遗传背景资料。

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