牛传染性鼻气管炎病毒的分离鉴定与灭活疫苗免疫效果研究

赵 卓，胡义彬，潘延钵，贺亚奇，邓玉芹，王 力，2(.北京生泰尔生物科技有限公司，北京昌平02206;2.北京华夏兴洋生物科技有限公司，北京大兴02629)

牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)是引起牛的一种急性热性接触性传染病，以高热、呼吸困难、鼻炎和上呼吸道炎症为特征。该病在世界各地普遍存在，主要的经济损失在于延缓肥育牛的生长和增重，患病奶牛产乳量下降，继发流产，其流产率有时高达50%，急性发病期牛死亡率可达10%[1]。文献报道我国大部分地区也存在该病的流行，并由疑似病例中成功分离到了IBR病毒[2-4]，但很多牛场仍缺乏对牛传染性鼻气管炎病的足够认识。控制本病的主要措施在于应用疫苗进行免疫预防接种。但在我国，目前尚无IBR疫苗产品上市。本研究成功分离到了一株免疫原性良好的牛传染性鼻气管炎病毒，并采用该毒株进行了灭活疫苗的初步研究。

1 试验材料

1.1 病料 疑似发病牛眼鼻分泌物及生殖道分泌物。

1.2 细胞、抗原及血清 MDBK细胞、IBRV中和试验抗原、IBR阳性血清均购自中国兽医药品监察所菌种保藏中心。

1.3 试验动物 1～3月龄IBR中和抗体≤1∶2的健康犊牛25头，购自北京市北郊奶牛场。体重为

1.5 ～2 kg日本大耳白家兔20只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.4 试剂 DMEM培养基，GBICO公司;胎牛血清，兰州民海生物工程有限公司;Taq聚合酶，宝生物工程(大连)有限公司;PCR引物，由上海生物工程技术有限公司合成;疫苗佐剂(603佐剂)，由北京生泰尔生物科技有限公司提供。

1.5 仪器设备 PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、96孔细胞培养板、CO2细胞培养箱、倒置生物显微镜，由北京生泰尔生物科技有限公司提供。

2 试验方法

2.1 病料采集与处理 选取表现典型IBR临床症状的5头牛，分别采集鼻腔拭子和生殖道分泌物拭子，放入运输培养液中(含1000单位/mL青霉素、1000 μg/mL链霉素和20%血清的DMEM)，4℃作用过夜。冻融2次后，10000 r/min离心10 min，取上清液用0.22 μm微孔虑膜进行虑过除菌，-20℃保存。

2.2 病毒分离 取上清液1 mL接种于长满MDBK细胞单层的细胞培养瓶中，37℃吸附1 h，倾去液体，加入维持液(含青霉素200单位/mL、链霉素200 μg/mL和2%血清的DMEM)，于37℃，含5%CO2的培养箱中培养，每天观察细胞病变(CPE)，待70% ～80%细胞出现CPE时收毒，如果细胞不出现CPE，5 d后盲传，连续盲传3代。

2.3 病毒蚀斑克隆纯化 将病毒培养液做10倍系列稀释到10-6，接种长成良好的MDBK细胞单层的6孔细胞培养板;每孔接种病毒稀释液200 μL，每个稀释度病毒液接种2孔，置细胞培养箱中吸附1 h，每20 min摇动一次使病毒分布均匀;吸附后弃去6孔板内病毒液;然后取细胞培养液加入等量的1%琼脂(60℃水浴加热)中，混匀，冷却到40℃时加入细胞培养板中，每孔加入2～3 mL，凝固后置37℃含5%CO2的细胞培养箱中继续培养;待适当稀释度出现单个蚀斑后，吸取噬斑处琼脂加入营养液中使其溶解后作为收获病毒，收获后的病毒液接种单层MDBK细胞继续培养增殖。

2.4 病毒TCID50的测定 待96孔细胞培养板中的MDBK细胞长满单层后，将病毒做10倍系列稀释后，每一稀释度接种8孔，0.1 mL/孔，37℃吸附1小时，补加细胞维持液，0.1 mL/孔。培养板置37℃，含5%CO2的培养箱中培养，逐日观察7 d后，采用Reed-Muench法，计算IBR病毒TCID50。

2.5 血清中和试验 将IBRV阳性血清于56℃灭活30 min后，作连续2倍倍比稀释后，加入等体积的IBR病毒(200 TCID50/0.1mL)，37℃中和1 h。然后将血清-病毒中和液加入长满单层MDBK细胞的96孔板中，每个血清稀释度接种4孔，每孔0.2 mL。于CO2培养箱中培养，逐日观察细胞病变。

2.6 PCR检测

2.6.1 引物设计与合成 根据Genbank中公布的IBRV全基因序列，选取gB蛋白全基因组序列，利用Primer Premier 5软件设计如下引物序列进行目的基因片段的扩增:

gb-F:5’-CGAGGAAGAGGAGGAGTTTGACG-3’

gb-R:5’-GCACCCGAACTGCCCATACATAG-3’

2.6.2 病毒DNA的提取 将病毒培养物冻融2～3 次后，取560 μL 加入30 μL 100 g/L SDS和3 μL 20 g/L蛋白酶K，37℃水浴60 min，先后以酚/氯仿和氯仿各抽提1次，0.8倍体积异丙醇沉淀，700 mL/L乙醇洗涤，干燥后加适量无核酸酶水溶解。

2.6.3 PCR扩增 50 μL反应体系中加入10×Ex Taq buffer 5 μL、dNTP(各 2.5 mmol/L)4 μL、MgCl2(25 mmol/L)4 μL、引物(20 μmol/L)各0.5 μL、Ex TaqTM 酶 0.25 μL、病毒 DNA 2 μL、ddH2O至50 μL。瞬间离心后进行PCR扩增。同时设MDBK细胞DNA和无DNA的空白对照。扩增条件为:95℃预变性5 min，95℃ 1 min，65℃45 s，72 ℃ 45 s，10 个循环;95 ℃ 1 min，54 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，15个循环;95 ℃ 1 min，60 ℃ 45 s，72 ℃45 s，10个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物用20 g/L琼脂糖凝胶电泳后观察结果。

2.6.4 目的片段测序 将PCR扩增产物回收后进行序列测定，根据测序结果做进一步验证。

2.7 动物回归试验 选用IBR抗体阴性牛5头，其中3头采用滴鼻和喷雾的方式共接种IBRV液10 mL(含107.3TCID50)，每天测定体温，观察临床症状。另2头作为空白对照组，试验组与对照组隔离饲养。试验牛出现典型的临床症状时，采集眼鼻或阴道分泌物进行病毒分离和PCR检测，发病后3～5 d扑杀作病理解剖学观察。

2.8 疫苗的制备 将IBRV进行增殖培养后，进行病毒含量测定和无菌检验，检验合格后进行病毒灭活。然后将病毒灭活液与603佐剂按照2∶1的比例混合、搅拌均匀。

2.9 疫苗的检验

2.9.1 常规检验 按照现行《中国兽药典》的方法分别进行无菌检验、稳定性检验、黏度检验、甲醛残留检验[5]。

2.9.2 小白鼠安全性检验 每批疫苗经背部皮下接种IBR灭活疫苗0.3 mL，每组10只，观察14 d，记录小白鼠的死亡情况及全身和局部的不良反应。

2.9.3 效力检验 每批IBR灭活疫苗免疫接种5头牛，每头牛肌肉注射2 mL，21 d加强免疫一次。同时每批疫苗免疫接种家兔5只，每只肌肉注射0.5 mL，21 d以同样剂量加强免疫一次。二免后14 d采血，分离血清，进行血清中和抗体测定。

2.9.4 攻毒保护试验 IBR灭活疫苗二免后14 d进行采血后，随即连同对照牛进行攻毒，每头牛采用滴鼻的方法接种F4代牛传染性鼻气管炎病毒10 mL(含107.3TCID50)，攻毒后每天观察临床症状和体温变化，观察15 d。根据牛的发病情况计算免疫牛的攻毒保护率。

3 结果

3.1 病毒分离和TCID50测定 采集疑似发病牛鼻腔拭子和生殖道分泌物拭子样品接种MDBK细胞后，其中1份样品在第1代的第3天出现死亡细胞明显增多的现象，而对照细胞生长良好(图1);传至第2代，在第2天观察到特异性CPE，表现为细胞圆缩，聚集，在单层细胞上形成空洞，之后细胞脱落(图2)，第3天70% ～80%细胞出现CPE，细胞圆缩、死亡、脱落。病毒培养物经蚀斑纯化后连续传3代，CPE出现的时间和病变特征与前几代相似。收获蚀斑纯化后的第3代病毒培养物，冻融1次，分装，经TCID50测定，病毒毒价为107.7TCID50/mL。

3.2 病毒蚀斑克隆纯化 将第2代病毒培养物进行病毒蚀斑纯化，结果在第4天即可看到典型的病毒蚀斑(图3)，吸取蚀斑处琼脂收获病毒，收获后的病毒液接种单层 MDBK细胞继续培养增殖，在MDBK单层细胞上仍可出现典型的细胞病变效应。

3.3 血清中和试验 阳性血清做1∶16倍稀释后可以与IBR病毒培养物完全中和，MDBK细胞对照无细胞病变产生。而32倍稀释的血清与病毒中和后有1/4孔细胞出现细胞病变，细胞呈现园缩聚集成团，细胞间出现空洞，最后圆缩脱落。

3.4 PCR扩增 图4结果显示，分离培养物和IBRV标准株均能扩增出与目的基因片段大小一致的特异性条带。

图4 IBRV特异性片断基因扩增结果

3.5 扩增产物测序 将PCR扩增产物回收后送上海生物工程技术有限公司进行测序。测序结果采用序列分析软件分析，并将测序序列与GenBank中的牛IBR病毒基因序列进行Blast比对，基因序列同源性达99%。

3.6 动物回归试验 3头犊牛在攻毒后24 h出现发热，温度达到40.9℃;攻毒后3 d，3头牛均出现鼻镜潮红，流泪，精神萎靡，食欲减退的症状;观察至第5天，牛的鼻腔及眼角有多量的浓性分泌物，出现咳嗽、拒食、发热等典型症状，与IBR临床症状相符。其中1头牛在攻毒后20 d临床症状逐渐减轻，食欲逐渐恢复。另外一头牛进行剖检观察，可见气管出血，粘膜脱落，牛鼻腔中充满了脓性分泌物，堵塞整个鼻道。

3.7 病毒分离与PCR检测 结果显示，分离物在MDBK细胞上能产生典型细胞病变效应，病毒培养物PCR检测结果呈阳性，确诊为IBR病毒感染发病。

3.8 疫苗的制备和检验 将实验室制备的三批IBR灭活疫苗分别进行各项检验。表1结果表明，采用603佐剂制备的IBR灭活疫苗性状良好、稳定性好、黏度低、对小白鼠安全。

3.9 疫苗效力检验 将制备的三批灭活疫苗分别免疫抗体阴性牛，并对免疫牛进行IBR病毒攻毒试验和中和抗体效检测定。表2结果表明，免疫后IBR中和抗体效价较高，抗体效价几何平均值可达1∶41以上，攻毒后免疫组牛均无IBR临床症状，可达5/5保护。而对照组牛出现不同程度的发热，持续高温3 d以上，鼻镜潮红，流泪，眼睛有浓性分泌物，食欲减退等症状，剖检后观察可见对照组牛的鼻腔内有脓性分泌物，靠近肺端气管有大量的白色泡沫等病理变化。免疫家兔后抗体效价几何平均值也可达1∶42以上，初步表明牛和家兔二者抗体效价存在一定的平行性。

表1 三批IBR灭活疫苗各项检验结果

表2 三批IBR灭活疫苗免疫效力试验结果

4 小结

本研究采用MDBK细胞成功从疑似病例牛的鼻腔分泌物、阴道分泌物拭子中分离出IBR病毒。病毒在MDBK细胞上可产生明显的细胞病变效应，且能被IBR阳性血清完全中和。采用特异性引物进行PCR检测，可扩增出特异性目的片段，扩增产物经测序与已发表的IBRV基因组序列一致。结果表明分离株为IBR病毒，从而也进一步证实了本病在我国的存在。

国外采用IBR灭活疫苗防控本病取得了很好的效果[6-7]，但在国内该疫苗的研制尚处于实验室研究阶段[8]。本研究制备的IBR灭活疫苗免疫抗体阴性牛，中和抗体效价平均值可达1∶41以上，高于美国联邦法规(9CFR)标准(≥1∶8)，证明疫苗免疫效果理想，为下一步开展IBR灭活疫苗新产品研发奠定了基础。

[1]王家驹，李亚明.牛传染性鼻气管炎的研究[J].中国畜禽，1994，76(3):1-3.

[2]封启民.我国牛传染性鼻气管炎血清抗体普查报告[J].动物检疫，1982，(1):36-39.

[3]王淑娟，孙成友，宋晓晖.牛传染性鼻气管炎的诊断、流行病学调查及防控[J].中国畜牧兽医文摘，2012，28(9):95-96.

[4]徐晓琴，冷 血，李真光，等.牛传染性 鼻气管炎病毒IBRV-LN01/08株的分离鉴定[J].中国兽医科学，2010，40(4):352-356.

[5]中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○一○年版三部[S].

[6]Pospisil Z，Krejci J，Jinek P，et al.Development of a disease control programe based on the use of an inactivated vaccine against infectious bovine rhinotracheitis[J]. Veterinary Micrology，1996，53:199-206.

[7]Patel J R.Relative efficacy of inactivated bovine herpesvirus-1(BHV-1)vaccines[J].Vaccine，2005，23:4054–4061.

[8]冷 血，赵炳武，郭 利，等.牛传染性鼻气管炎灭活疫苗的安全性和免疫保护效果[J].中国兽医科学，2010，40(11):1161-1165.