碳酸钙联合阿法骨化醇对去卵巢大鼠骨质疏松防治作用

唐祝奇 ，秦 宁 ，刘 春 ，朱晓晖 ，印 彤 ，崔世维

（1南通大学附属医院内分泌科，江苏226001；2南通大学实验动物中心）

骨质疏松(osteoporosis,OP)指骨量减少、骨组织微观结构退变，致骨脆性增高而骨折危险增加的一种全身性骨病[1]。绝经后OP已成为临床常见的代谢性骨病，其严重后果为发生骨质疏松性骨折[2]。防治的基本措施为生活方式干预，包括摄入充足的钙和维生素D、适当的体力活动和预防摔倒[3]。钙剂的摄入可减缓骨的丢失，改善骨矿化；活性维生素D有利于钙在胃肠道的吸收，促进骨形成和矿化，增加肌肉力量和平衡能力，降低跌倒或者骨折风险[4]。两者联用预防绝经后OP的报道较少。本研究采用去卵巢大鼠骨质疏松模型，研究碳酸钙联合阿法骨化醇预防绝经后OP的作用，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 清洁级5月龄Wistar雌性大鼠40只［南通大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(苏)2008-0010；实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2002-0022］，体质量 250～300g，平均(279.6±10.7)g。分笼饲养在(24±2)℃、通风良好、湿度60%～70%的实验条件下，以不含豆类的标准鼠饲料喂养，自由摄水。随机分为5组，每组8只：假手术组、模型组、碳酸钙组、阿法骨化醇组、碳酸钙+阿法骨化醇联合组。

1.2 大鼠模型制备 适应性饲养1周，各组大鼠腹腔注射2%苯巴比妥(40mg/kg)麻醉，常规消毒腹部皮肤，沿腹正中线剪开皮肤，分离肌肉、筋膜，剪开脏层腹膜，暴露腹腔。假手术组切除卵巢附近约卵巢大小脂肪组织，其余各组结扎及剪断双侧卵巢组织，分层缝合肌肉、皮肤。术后青霉素20万U肌肉注射，1次/d，连续 3d。

1.3 给药方法 术后5天开始给药。试验过程中每周称1次体重，根据体重调整给药剂量。假手术组及模型组蒸馏水灌胃20 mg/kg，每天1次；碳酸钙组按20 mg/kg灌胃给药，每天1次；阿法骨化醇组按0.05μg/kg给药，每日1次；联合组按碳酸钙20mg/kg+阿法骨化醇0.05μg/kg给药，每日1次。连续给药12w。

1.4 组织标本的留取 自给药日始饲养12周，空腹14 h称重，麻醉后处死，腹主动脉收集血液，分离血清保存于-20℃冰箱待测。分离腰椎、左侧股骨及胫骨，剔除骨表面软组织，生理盐水浸泡的湿纱布包裹并密封编号，置于-20℃冰箱待测。取出子宫，称量子宫湿重，计算其与每100g体质量的百分率，记作子宫指数(mg/100g)。

1.5 指标的检测 采用ELISA法测定血雌激素、骨钙素(bone gla protein，BGP)、血清抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)。采用美国Hologic QDR24500W型双能X线骨密度仪，应用小动物软件进行腰椎和左股骨、胫骨扫描。

1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对数据进行统计学处理，计量资料以（±s）表示，前后比较采用t检验，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 体重、子宫指数及雌激素水平 各组大鼠术前体重差异无统计学意义（P＞0.05）。各组大鼠12周时体重与术前体重相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与假手术组相比，模型组12周时体重增加，雌激素下降，子宫系数变小（P＜0.05），其余各组间体重差异无统计学意义（P＞0.05）。碳酸钙组、阿法骨化醇组、联合组子宫系数大于模型组（P＜0.05），小于假手术组（P＜0.05）。碳酸钙组、阿法骨化醇组雌激素高于模型组（P＜0.05），小于假手术组及联合组（P＜0.05），假手术组及联合组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 1。

表1 各组体重、子宫指数及雌激素水平比较（±s）

表1 各组体重、子宫指数及雌激素水平比较（±s）

与假手术组相比，*P＜0.05；与模型组比较，﹟P＜0.05；与联合组比较，△P＜0.05

雌激素(pg/mL)假手术组 302.6±14.4 331.1±17.1 0.25±0.03 46.81±10.42模型组 325.9±33.6 381.5±39.3*0.06±0.03*15.79±3.73*碳酸钙组 306.1±12.3 337.4±36.2 0.12±0.10﹟*21.50±3.93△阿法骨化醇组 306.5±23.7 351.0±21.9 0.11±0.07﹟*27.93±5.41△联合组 326.8±20.6 337.0±26.9 0.09±0.04﹟*50.00±8.08分组 初体重(g)末体重(g)子宫系数(×100)

2.2 骨代谢指标 模型组骨钙素增加，与假手术组相比差异无统计学意义（P＞0.05），显著高于碳酸钙组、阿法骨化醇组（P＜0.05）；联合组骨钙素显著低于其他各组（P＜0.05）。模型组血清抗酒石酸酸性磷酸酶及其活性增加，与假手术组相比差异无统计学意义（P＞0.05），显著高于碳酸钙组、阿法骨化醇组（P＜0.05）；联合组血清抗酒石酸酸性磷酸酶及其活力高于碳酸钙组、阿法骨化醇组（P＜0.05），与假手术组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组骨钙素、血清抗酒石酸酸性磷酸酶及活力比较（±s）

表2 各组骨钙素、血清抗酒石酸酸性磷酸酶及活力比较（±s）

与联合组比较，*P＜0.05；与碳酸钙组及阿法骨化醇组相比，＃P＜0.05

TRAP活性单位(×100)假手术组 6.10±0.49* 0.47±0.18 0.40±0.15模型组 8.03±0.60*＃ 0.59±0.14＃ 0.50±0.12＃碳酸钙组 5.93±0.29* 0.35±0.11 0.30±0.09阿法骨化醇组 6.19±0.34* 0.38±0.10 0.32±0.08联合组 3.89±0.41 0.49±0.19＃ 0.42±0.16＃分组 骨钙素(ng/mL)TRAP(μmol/L)

2.3 骨密度 实验12周各组腰椎、股骨、胫骨骨密度组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。腰椎骨密度以模型组最低（P＜0.05），其余各组差异无统计学意义（P＞0.05）；股骨、胫骨骨密度假手术组与联合组间差异无统计学意义（P＞0.05），与其余各组相比增高差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 各组骨密度比较（±s）

表3 各组骨密度比较（±s）

与联合组比较，*P＜0.05；与模型组、碳酸钙组及联合组相比，＃P＜0.05

分组 腰椎(g/cm2) 股骨(g/cm2) 胫骨(g/cm2)假手术组 0.18±0.03 0.23±0.02＃ 0.27±0.03＃模型组 0.16±0.02* 0.20±0.01 0.23±0.02碳酸钙组 0.22±0.01 0.21±0.02 0.22±0.02阿法骨化醇组 0.22±0.02 0.22±0.01 0.24±0.02联合组 0.22±0.01 0.28±0.05＃ 0.27±0.04＃

3 讨 论

美国食品与药物管理局和世界卫生组织推荐的去卵巢大鼠是研究绝经后骨质疏松症的最佳模型，是使用最普遍且研究最广泛的实验用OP动物模型[5]。雌性大鼠在6～10月为成年期，本实验选择5月龄大鼠进行去卵巢手术，手术12 w后,子宫萎缩，体重增加，骨密度显著降低，骨钙素及血清抗酒石酸酸性磷酸酶上升，出现骨质疏松，提示手术造模成功[6]。

骨矿物质的丢失是OP的主要病理改变，钙是构成人体矿物质重要的微量元素，补充钙剂是治疗OP的安全而有效的措施[7]。但钙在小肠的吸收需要钙结合蛋白，钙结合蛋白受1，25-二羟维生素D3的调节。维生素D及其衍生物可促进肠道钙的吸收，同时促进肾小管对钙的重吸收，并可与甲状旁腺素、降钙素协同作用，提高血钙、血磷的浓度，促进骨钙化和骨形成[8]。阿法骨化醇属于活性维生素D，在肝脏被迅速转化成1，25-二羟维生素D3[9]。大量研究表明阿法骨化醇能增加肾小管对钙的重吸收，减少尿钙流失；并能抑制甲状旁腺增生，减少甲状旁腺激素合成与释放，抑制骨吸收[10]。

本研究显示，碳酸钙及阿法骨化醇单独应用可降低去卵巢大鼠升高的骨吸收指标BGP、TRAP，延缓骨密度降低，两者联用BGP、TRAP降低更明显，骨密度降低更缓慢。同时发现，去卵巢大鼠骨密度降低以股、胫骨明显，腰椎骨密度降低不显著，推测可能与负重程度不同有关。本研究结果提示钙剂、维生素D3单独或联用可减少绝经相关的骨密度下降，防治骨质疏松[11]，其临床效果值得进一步研究。

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