大鼠的洛伐他汀在体肠吸收机制

陈文珠 陈 豆(广东省中医院药学部，广东 广州 5020)

洛伐他汀能显著降低血浆中胆固醇和低密度脂蛋白水平，具有良好的降血脂作用〔1〕，且不存在胆固醇类物质蓄积，在治疗剂量下不会影响细胞膜正常功能所需要的胆固醇量，不良反应较小。目前其上市剂型有普通片剂和胶囊剂，但半衰期较短(t1/2=3 h)。本文研究其在大鼠小肠不同部位的吸收情况。

1 材料与方法

1.1 仪器 Dionex高效液相色谱仪、电子分析天平(日本岛津公司);XW-80A微型涡旋混合仪(上海市沪西分析仪器厂有限公司);TG16B高速离心机(湖南长沙凯达科学仪器有限公司);BT00-100 M蠕动泵(保定兰格恒流泵有限公司)。洛伐他汀对照品(中国食品药品检定研究院，批号:100600-200301，纯度:99.5%);甲醇(天津科密欧化学试剂开发中心，色谱纯);水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

1.2 动物 雄性SD大鼠，2个月龄，体质量(220±20)g，广州中医药大学实验动物中心提供，许可证:SKXK(粤)2010-0010。

1.3 对照品溶液 精密称取洛伐他汀对照品5.0 mg，置于5 ml量瓶中，以甲醇溶解定容，得1.0 mg/ml的对照品溶液。

1.4 灌流供试液 精密称取洛伐他汀对照品适量，置于50 ml量瓶中，以Krebs-Ringer缓冲液(K-R 液)〔2〕溶解定容，即得灌流供试液。

1.5 单向肠灌流试验〔3〕取禁食12 h的SD大鼠，自由饮水，腹腔注射25%乌拉坦(40 mg/kg)麻醉，沿腹中线打开腹腔，分离待考察肠段(十二指肠、空肠、回肠)，取约10 cm于两端切口，插入硅胶管后结扎。用生理盐水(37℃)冲洗肠道，用空白K-R液灌流，取0.25～2.0 h的灌流液，得空白灌流液。另取灌流供试液(37℃)灌流肠道，以0.2 ml/min的流速平衡45 min，进口处用已知质量的装有灌流供试液的小瓶灌流，出口处用另一已知质量的小瓶收集，每隔15 min迅速更换下一个灌流供试液小瓶和接收液小瓶，称质量，计算灌入和收集的灌流液质量。实验持续105 min，实验结束，剪下被考察肠段，测量长度(l)和内半径(r)。肠段区间:十二指肠段为自幽门下1 cm处开始，空肠段为自幽门15 cm处开始，回肠段为自盲肠上行20 cm处开始。

1.6 灌流液体积的校正 采用质量法校正因肠内水分吸收引起灌流液体积的变化。精密量取灌流供试液1.0 ml，置于已称重的干净玻璃瓶中，称量，计算其密度ρin。从收集的灌流液样品中各精密量取1.0 ml，置于已称重的干净玻璃瓶中，称量，计算其密度ρout。min和mout分别为灌入和收集的灌流液质量，则Vin=min/ρin;Vout=mout/ρout。

1.7 数据处理 采用质量法计算洛伐他汀的吸收速率常数(Ka)和表观速率常数(Papp)。

式中，V为灌流肠段的体积(ml)，cin和cout分别为肠道灌入和收集的灌流液的质量浓度(mg/L)，Vin和Vout分别为灌入和收集的灌流液的体积(ml);Qin为灌流速度(ml/min)。

1.8 统计学分析 采用SPSS13.0软件进行t检验。

2 结果

2.1 系统适用性试验 色谱柱:Kromasil KR 100-5 C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇、水(75∶25)，流速1 mg/min;柱温:室温;检测波长:236 mm;进样量:20 μm。取空白灌流液、洛伐他汀对照品溶液和空肠吸收样品各1.5 ml，于离心机中15 000 r/min离心15 min，取上清液过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液20 μl进样，测定。结果表明，在该色谱条件下，空白灌流液对洛伐他汀的测定无干扰。见图1。

2.2 标准曲线的制备 取洛伐他汀对照品溶液0.5 ml，置于5 ml量瓶中，加入甲醇定容，得100.0 mg/L的溶液。分别移取该溶液适量于2 ml量瓶中，以甲醇定容，得0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0 mg/L 的系列标准品溶液，各进样 20 μl，测定。以洛伐他汀的峰面积(Y)对质量浓度(X)进行线性回归，得回归方程为Y=0.108 6X－0.238 7(r=0.999 1)。结果表明，洛伐他汀检测质量浓度的线性范围为0.25～25.0 mg/L。

图1 高效液相色谱图

2.3 精密度试验 取5.0、10.0、25.0 mg/L的洛伐他汀对照品溶液，于1 d内测定5次，计算日内RSD;每日测定1次，连续测定5 d，日内RSD为1.24%，日间RSD为2.09%。

2.4 稳定性试验 用空白灌流液制备含洛伐他汀5.0、10.0、25.0 mg/L的样品溶液，置于37℃恒温水浴中孵育，分别于0、0.5、1、2、3 h取样，考察洛伐他汀的稳定性。结果，洛伐他汀在3 h内的RSD均＜2.5%，表明其在空白灌流液中稳定较好。

2.5 影响药物肠吸收的因素

2.5.1 药物质量浓度对肠吸收的影响 用K-R液制备含洛伐他汀5.0、10.0、25.0 mg/L的供试液，以空肠为灌流部位，进行大鼠在体单向肠灌流实验，每个浓度重复4次，计算Ka和Papp，考察灌流液质量浓度对洛伐他汀肠吸收的影响。结果，5.0、10.0、25.0 mg/L的供试液的 Ka分别为(0.132±0.009)、(0.145 ± 0.013)、(0.047 ±0.007)/min，Papp分别为(0.017 ±0.004)、(0.026 ± 0.006)、(0.005 ±0.001)cm/min，且组间比较有显著性差异(P﹤0.05)，有高浓度饱和现象，表明药物的转运可能有载体的参与。

2.5.2 吸收部位对肠吸收的影响 取待考察的十二指肠、空肠和回肠各10 cm，以“2.5.1”项下10.0 mg/L的供试液，进行大鼠在体单向肠灌流实验，重复4次，计算各肠段的Ka和Papp。十二指肠、空肠和回肠的Ka分别为(0.141±0.005)、(0.144±0.011)、(0.145±0.003)/min，Papp分别为(0.025±0.005)、(0.026±0.003)、(0.026±0.002)cm/min，各肠段间比较无明显差异(P﹥0.05)，表明洛伐他汀在小肠各段的吸收较好，无特定吸收部位。

3 讨论

研究药物肠吸收的方法有离体法、在体法、体内法等〔4〕，其中在体法应用更为广泛。在体法主要包括在体循环法〔5〕和单向灌流法，前者由于长时间以较高流速回流供试液，会对肠黏膜造成损伤，导致药物在肠道内吸收增大，使测得值与真实值产生较大偏离;而后者以较低流速对一定肠段进行灌流，保证研究部位的淋巴和血液循环系统完整，因此明显优于离体法，其中单向灌流法与人体有良好的相关性而被应用最多〔6，7〕。

因肠道对水分部分吸收，所以需要对灌流液体积的变化进行校正。有研究曾采用不被肠吸收的酚红为标示物以标示灌流液体积变化〔8〕，但酚红也有一定吸收，且干扰药物的肠道转运和分析测定〔9〕。与酚红法相比，重量法能明显减小实验误差，更真实地反映肠道吸收水分的实际情况，且降低了检测的工作量，是一种值得推广的大鼠在体肠吸收研究方法。灌流速度在一定程度上代表肠道蠕动的生理状态，在健康志愿者体内肠灌流实验中，灌流速度多选用2～3 ml/min，由于大鼠肠道的内径为人肠道的1/10〔11〕，因次本实验将大鼠肠灌流速度选为0.2 ml/min。不同质量浓度下，洛伐他汀的吸收速率有显著差异，且有高浓度饱和现象，表明药物的转运可能有载体的参与，有待进一步研究。洛伐他汀在小肠各段间吸收速率常数无显著差异，表明其无特定吸收部位。洛伐他汀在小肠各段均吸收较好，故适宜将其制成缓释制剂，延长药物在小肠的滞留时间，以减少服用次数，提高其生物利用度和患者的顺应性。

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