β-连环蛋白和环氧化酶-2在舌癌中的表达及其相关性

王 鹏 李 乐 苏哲君 霍 峰 王笑茹 李春辉 (承德医学院附属医院口腔科，河北 承德 067000)

目前有关 β-连环蛋白(β-catenin)、环氧化酶-2(Cox-2)在肿瘤发生发展和侵袭转移的研究日益受到人们的关注〔1，2〕。本研究采用免疫组织化学的方法检测舌癌组织及正常口腔黏膜中β-catenin、Cox-2的表达情况，探讨两者在舌癌发生发展及转移过程中的作用及相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集承德医学院附属医院口腔科2006～2011年手术切除及活检后经病理诊断明确的存档舌癌标本60例，男37例，女23例，年龄40～75岁，平均55.3岁。所有患者手术前均未经放疗、化疗或免疫治疗;所有舌癌病例均经承德医学院附属医院病理科资深医师组织病理学证实，病理诊断标准参照2002年《头颈部肿瘤病理学与遗传学》，病理分型为高分化19例，中分化26例，低分化15例。伴有淋巴结转移者32例，无淋巴结转移者28例。收集舌外伤、舌修整正常舌黏膜组织30例作为正常对照。

1.2 标本处理 检测标本置40 g/L的中性甲醛溶液中固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋，切片厚4 μm。

1.3 主要试剂及仪器 Cox-2(美国Santa Cruz)、β-catenin鼠抗人单克隆抗体(美国Santa Cruz);SP染色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)。

1.4 方法 S-P法免疫组化染色:采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS液处理，分步滴加一抗、生物素标记二抗及过氧化物酶溶液进行孵育，DAB显色;复染，逐级脱水，透明，封片。

1.5 结果判定标准 β-catenin免疫组化阳性信号为细胞内出现棕黄色细小颗粒，染色判断标准按照文献〔3〕研究方法。细胞膜表达减弱或缺失及异位表达统称为异常表达。Cox-2表达结果判定:细胞质或细胞膜或细胞核呈棕褐色或棕黄色(细颗粒)为Cox-2阳性细胞。在高倍镜下(×100)随机选择5个视野，每个视野计数200个细胞，计算平均百分率。

1.6 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件，两样本率的比较采用四格表资料的χ2检验，不满足χ2检验条件时采用Fisher精确概率检验法;相关分析使用Spearman相关分析。

2 结果

2.1 β-catenin和Cox-2在正常舌黏膜及舌癌中的表达 见图1。β-catenin在正常舌黏膜中全部明显表达，主要定位于细胞膜，仅少数胞质弱表达，未见核表达。正常口腔黏膜组织中Cox-2均为阴性表达。在舌组织中，β-catenin异常表达率为72%，主要为细胞膜表达减弱，向胞质或胞核转位，出现异常表达，或胞膜胞核都不表达，而且大多数伴有不同程度细胞膜表达缺失。Cox-2在舌癌组织中阳性表达定位于肿瘤细胞胞质，为棕色颗粒，阳性表达率80%。

2.2 β-catenin和Cox-2表达与舌癌临床病理特征的关系 见表1。β-catenin和Cox-2表达与年龄、性别无关，β-catenin异常表达与肿瘤TNM分期和有无淋巴结转移相关(P＜0.01)，Cox-2阳性表达与组织分化程度、肿瘤TNM分期和有无淋巴结转移相关(P＜0.01)。

图1 β-catenin、Cox-2蛋白的表达(DAB，×100)

2.3 β-catenin和Cox-2在舌癌中表达的相关性 β-catenin与Cox-2的表达呈正相关(r=0.867，P＜0.001)。

表1 β-catenin和Cox-2表达与舌癌临床病理特征的关系(n)

3 讨论

β-catenin是一种由连环蛋白基因编码的多功能蛋白质。正常情况下，β-catenin仅表达于细胞膜，少量表达于胞质细胞质，在胞核内无表达。具有参与细胞黏附与Wnt通路信号传导双重功能，对于维持上皮细胞的组织结构完整和抑制肿瘤的侵袭及新陈代谢过程起着重要的作用〔3〕。肿瘤细胞中的Wnt信号通路异常可促使肿瘤的发生。Wnt通路活化后，胞质中游离β-catenin蛋白增多，使β-catenin在胞质内积聚，并转移至细胞核与转录因子Tcf/Lef结合，形β-catenin-TCF/LEF转录复合体，激活下游相关基因 c-myc、Cox-2、cyclinD1等，导致肿瘤发生〔4〕。多项研究〔5～7〕表明，β-catenin 在细胞膜表达减少可使细胞失去黏附功能导致细胞分散，癌细胞表型改变获得高侵袭性，易于发生浸润与转移。本研究结果表明，β-catenin可能在舌癌的细胞黏附和肿瘤细胞浸润转移方面发挥了重要作用。

在许多促炎和致突变因素的刺激下，Cox-2可被诱导出来，参与病理过程。有研究表明，Cox-2对于淋巴结的转移可以提供有益条件，Cox-2还直接改变肿瘤细胞表型，促进肿瘤细胞浸润侵袭的机制。Cox-2可以通过PGE2来参与调控肿瘤的生长与分化，PGE2通过G蛋白耦联途径等来促进细胞的生长，Cox-2也可能通过诱导Bcl-2等的表达从而导致肿瘤的发生。郭贵龙等〔8〕研究表明Cox-2参与并促进了肿瘤新生血管的发生发展。O'Connor等〔9〕研究发现Cox-2的水平与预后有密切关系，Cox-2水平较高的预后较差。本实验发现，Cox-2在舌癌中阳性表达率为80%，并与组织分化程度、TNM分期和有否无淋巴结转移相关，但在正常组织中未见表达。舌癌组织中Cox-2高表达，可能与其诱导细胞增殖、抑制凋亡、增强肿瘤的侵袭性及转移活性，促进血管内皮生长因子(VEGF)生成从而促进肿瘤血管的形成有关〔10〕。结果提示，Cox-2可能是一个判断舌癌进展的恶性程度有价值的指标。

舌癌的发生发展涉及多个基因、分子水平的异常，舌体组织癌变是由多个因素参与及共同作用的结果。本研究提示βcatenin、Cox-2蛋白在舌癌的发生发展过程中相互影响，它们之间可能存在特殊的调控关系，其作用机制有待于进一步探讨。

1 Kim I，Kwak H，Lee HK，et al.β-Catenin recognizes a specific RNA motif in the cyclooxygenase-2 mRNA 3'-UTR and interacts with HuR in colon cancer cells〔J〕.Nucl Acids Res，2012;40(14):6863-72.

2 Chiang SL，Chen PH，Lee CH，et al.Up-regulation of inflammatory signalings by areca nut extract and role of cyclooxygenase-2 a polymorphism reveal risk of oral cancer〔J〕.Cancer Res，2008;68(20):8489-98.

3 Gao S，Eiberg H，Krogdahl A，et al.Cytoplasmic expression of E-cadherin and beta-catenin correlated with LOH and hypermethylation of the APC gene in oral squamous cell carcinomas〔J〕.Oral Pathol Med，2005;34(2):116.

4 Lim K，Han C，Dai Y，et al.Omega-3 polyunsaturated fatty acids inhibit hepatocellular carcinoma cell growth through blocking β-catenin and cyclooxygenase-2〔J〕.Mol Cancer Ther，2009;8(11):3046-55.

5 Moon RT，Kohn AD，de Ferrari GV，et al.Wnt and beta-catenin signaling:diseases and therapies〔J〕.Nat Rev Genet，2004;5(9):691.

6 Takahashi M，Tsurtoda T，Sdki M，et al.Identification of membrane-type matrixmetalloproteinase-1 as a target of the beta-catenin/Tef4 complex in human colorectal cancers〔J〕.Oncogene，2002;21(38):5861.

7 张卫民，高 岩.Wnt信号传导通路组成蛋白与口腔鳞状细胞癌的分化和增殖〔J〕.中华口腔医学杂志，2005;40(6):491.

8 郭贵龙，姚榛祥.环氧化酶-2在人乳腺癌中的表达及对肿瘤血管形成的影响〔J〕.中华外科杂志，2004;42(20):1271-2.

9 O'Connor JK，Avent J，Lee RJ，et al.Cyclooxygenase-2 expression correlates with diminished survival in invasive breast cancer treated with mastectomy and radiotherapy〔J〕.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2006;58(4):1034-40.

10 王维丽，张英怀，张杰英，等.口腔鳞状细胞癌中COX-2、VEGF和EGFR的表达及意义〔J〕.现代口腔医学，2006;20(3):277-80.