清利活血汤配合三黄生肌纱条对糖尿病溃疡大鼠肉芽组织中白介素1、内皮素1及碱性成纤维细胞生长因子含量的影响

段旭东 张雅兰 赵 辉 高 璇 王晓媛 (河北医科大学第二医院中医外科，河北 石家庄 050000)

糖尿病足(DF)是糖尿病患者主要的慢性合并疾病之一，其病程长、治疗难度大、花费高昂，目前普遍认为DF是一个全身性疾病，它既有内科疾病的临床表现，又有肢端溃烂，局部感染等外科疾病的症状和体征，所以在其治疗上，要重视内外科综合治疗〔1〕。我科采用清利活血汤配合三黄生肌纱条治疗糖尿病足多年，取得了良好的临床疗效。为探讨其作用机制，本实验复制了DF动物模型，并初步观察了二者对糖尿病溃疡大鼠肉芽组织中白介素1(IL-1)、内皮素1(ET-1)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)含量的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级Wistar大鼠32只，全部雄性，体重180～220 g，由河北医科大学实验动物中心提供，动物合格证号:1103043，室温20℃饲养，自由进食水。

1.2 药物

1.2.1 清利活血汤 黄芪20 g，山药15 g，当归12 g，桃仁9 g，红花 9 g，川芎 9 g，山楂 6 g，生地 9 g，玄参 20 g，苍术 9 g，银花12 g，黄连 6 g，土元 6 g，鱼腥草 15 g，上药加水 1 000 ml，浸泡2 h，武火煮开，文火煎煮15 min，将药液倒出，加水500 ml，煎煮15 min，将药液倒出与第一次药液混合，使用前分别浓缩成含2.42 g生药/ml的混悬液。冷藏保存。三黄生肌纱条:黄连、黄柏、姜黄、当归各15 g，生地30 g等，麻油500 g浸药3 d，微火煎熬至药枯，去药渣后加入黄蜡30 g，微火化开，浸入灭菌纱布条，低温储存待用。

1.2.2 盐酸二甲双胍片 北京中惠药业有限公司产品，批准文号:国药准字 H19983069，批号20101112，0.25 g/片。

1.3 主要仪器及试剂 高压液相分析，VARIANT-2美国伯乐公司产品。酶联免疫检测仪，MK3，芬兰雷勃公司产品。全自动洗板机8×12，美国宝特公司产品。电热恒温水箱，600型，天津泰斯特公司产品。离心机，TDL-5-A，上海安亭科学仪器厂产品。循环水真空泵，SHB-D，郑州长城科工贸有限公司产品。γ-放射免疫计数器，FJ-2021，西安二六二厂，电动玻璃匀浆机DY89-1宁波新芝生物科技股份有限公司。立式低温冷藏箱，DW-40L262青岛海尔医用低温科技有限公司。高性能无菌实验台，DL-CJ-1N哈尔滨东联电子技术开发有限公司产品。电子天平HM-200日本。bFGF酶联免疫组化染色试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司产品。链脲佐菌素(STZ)，sigma公司产品，批号S-0130。IL-1、ET-1放免试剂盒，北京301医院放免所产品，批号20110525。

1.4 动物分组及用药 Wistar大鼠适应性饲养1 w后随机分为DF模型组、正常组、清利活血汤治疗组(治疗组)、二甲双胍治疗对照组(对照组)，每组8只。治疗组及对照组均从模型建立后第1天开始灌胃给药2 ml，每日1次，共用药15 d，用药剂量按有关公式，将成人临床用药剂量折算为大鼠用药剂量，模型组、正常组均以2 ml生理盐水替代药物每日1次灌胃，共15 d。各组大鼠均从手术后第1天起，每日清创1次，祛除创面上硬痂，常规消毒，用生理盐水冲洗创面。治疗组以三黄生肌纱条外敷，对照组用凡士林纱条外敷，正常组、模型组以生理盐水纱条外敷。创面外用无菌纱布包扎，胶布固定。

1.5 模型建立 32只雄性Wistar大鼠随机分为4组，每组8只，随机抽取1组为正常对照组，普通饲料喂养，余组高脂饲料喂养，4 w后禁食(不禁水)16 h，一次性腹腔注射低剂量STZ 30 mg/kg(用pH4.4的无菌枸橼酸缓冲液配成0.25%浓度);正常对照组腹腔注射等体积的0.1 mol/L无菌枸橼酸缓冲液，72 h后断尾取血，测定血糖，血糖＞16.65 mmol/L者成为成模大鼠，随机选取糖尿病大鼠按照血糖随机分为糖尿病模型组、治疗组、对照组。每组8只。4组动物在空腹8 h后均以10%水合氯醛1 ml/100 g体重腹腔注射麻醉，背部剃毛，常规消毒，用打孔器于大鼠背部脊柱左侧相同部位打孔(φ2 cm)，溃疡深及筋膜层，止血后以无菌纱布包扎，分笼饲养，自由饮水与进食，用药期间所有糖尿病大鼠继续以普通饲料喂养。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 糖化血红蛋白(HbA1c)测定 10%水合氯醛1 ml/100 g腹腔内注射麻醉后，切断大鼠右股动脉取血，置EDTA抗凝管内，采用高压液相法测定。

1.6.2 IL-1、ET-1的测定 采用放射免疫法，分别取肉芽组织2 g生理盐水冲洗3次，剪碎后移入高速匀浆器中，加入4℃生理盐水4 ml，高速研磨2 min，使组织充分匀浆，制备好的匀浆置离心机3 000 r/min离心15 min，提取上清液备用，测定时将样品稀释，取组织匀浆0.1 ml，先由自动γ-放射免疫计数器预先编制程序，直接给出标准曲线及浓度，然后测定IL-1、ET-1含量，并同时测得匀浆上清蛋白含量(g)进行校正。

1.6.3 bFGF测定 采用免疫组化法半定量测定，石蜡切片常规脱蜡，微波抗原修复，加 3%H2O2去离子水 3 ml，孵育5～10 min，以消除内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗，3 min×3次，滴加封闭用正常山羊血清工作液3 ml，室温孵育10～15 min，倾去，滴加适当比例稀释的一抗，4℃过夜，PBS冲洗3 min×3次，滴加生物素标记山羊抗大鼠IgG，37℃孵育10～15 min，PBS冲洗3 min×3次，滴加辣根标记链霉卵蛋白工作液3 ml，37℃孵育10～15 min，显色剂显色，冲洗，封片。计算机图像处理软件半定量测定bFGF含量，以染色吸光度值表示。

2 结果

2.1 大鼠创面肉芽组织bFGF含量的变化 与正常组比较，模型组大鼠肉芽组织中bFGF含量明显增高(P＜0.01)，与模型组比较，治疗组及对照组bFGF均较模型组明显降低(P＜0.01)，治疗组bFGF较对照组低(P＜0.05)。见表1及图1。

2.2 大鼠创面肉芽组织ET-1含量的变化 与正常组比较，模型组大鼠肉芽组织中ET-1含量明显增高(P＜0.01)，与模型组比较，治疗组及对照组ET-1均较模型组明显降低(P＜0.01)，治疗组ET-1较对照组低(P＜0.05)。见表1。

2.3 大鼠创面肉芽组织IL-1含量的变化 与正常组比较，模型组大鼠肉芽组织中IL-1含量明显增高(P＜0.01)，与模型组比较，治疗组及对照组IL-1均较模型组明显降低(P＜0.01)，治疗组ET-1较对照组低(P＜0.05)。见表1。

图1 各组大鼠创面肉芽组织bFGF表达(×400)

2.4 大鼠HbA1c的变化 与正常组比较，模型组大鼠HbA1c明显增高〔(18.15±1.86)%vs(6.48±1.28)%，P＜0.01〕，与模型组比较，治疗组及对照组HbA1c均较模型组明显降低〔(12.88±2.77)%，(15.01±1.64)%，P ＜0.01〕，治疗组HbA1c较对照组低，但差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 各组大鼠ET-1、IL-1、bFGF含量( s，n=8)

表1 各组大鼠ET-1、IL-1、bFGF含量( s，n=8)

与模型组相比:1)P＜0.01;与对照组相比:2)P＜0.01，3)P＜0.05

正常组 － 10.50±1.661)2)16.74±3.271)2)0.536±0.1271)2)模型组 － 19.81±1.89 50.97±7.45 0.202±0.042治疗组 14.5 g/kg 13.80±1.1813)28.34±4.4813)0.421±0.0541)3)对照组 75 mg/kg 16.02±0.911)38.13±7.571 0.290±0.038

3 讨论

DF是糖尿病的严重并发症，是糖尿病患者致死、致残的重要原因之一，不仅严重影响着糖尿病病人的寿命和生质量，也给家庭、社会和国家带来了沉重的经济负担。研究发现，在DF溃疡中，生长因子和其他伤口愈合所需要的介质发生异常〔2，3〕，从而影响了伤口愈合。因此深入研究这些因子在DF溃疡中的变化及作用，有助于揭示溃疡难以愈合的机制，并为临床治疗提供新的思路。

IL-1是典型的致炎细胞因子，几乎各种有核细胞均能产生，但不同的情况，不同的细胞，不同的浓度，IL-1的作用可能不同，甚至完全相反。在创伤后的急性炎症期，IL-1发挥着重要的作用，在伤后的第3～5天IL-1处于低水平，第8天达到高峰，肖正华等〔4〕的研究表明糖尿病足难治溃疡面上IL-1显著增高，进而抑制了成纤维细胞的增殖，从而使溃疡难以愈合。而降低溃疡面上IL-1含量，可加速创面愈合。

ET-1是一种21个氨基酸组成的多肽，是目前所知道的作用最强的血管收缩剂，其在糖尿病下肢坏疽的发生及预后中起着重要的作用。研究表明，血管内皮功能的改变是糖尿病血管并发症的始发因素，高血糖状态会损伤血管内皮细胞引起大量的ET释放〔5〕，从而使局部血管处于持续收缩状态，刺激血管平滑肌细胞增生，血小板凝聚，单核细胞变成泡沫细胞，形成粥样斑块，继发血栓，出现相应的肢体缺血表现。降低血浆中ET-1含量可加速创面愈合〔6〕，而对糖尿病足溃疡面组织中ET-1含量的情况尚未见报道。本研究显示大鼠糖尿病溃疡面中ET-1含量明显高于非糖尿病组，其溃疡面愈合亦较慢，而经治疗后ET-1含量下降，其溃疡面愈合较快，提示溃疡面高浓度ET-1阻碍肉芽生长、溃疡面愈合。

bFGF是一种多功能细胞生长因子，具有很广泛的生物活性，能刺激来源于中胚层和神经外胚层细胞的生长，如成纤维细胞、血管内皮细胞、上皮细胞等，在创面形成后的正常修复中起着重要的作用。近年来研究发现，由于溃疡创面的糖含量升高，使得晚期糖基化终末产物(AGEs)大量蓄积，一方面高糖状态可使FGF发生糖基化从而丧失其活性，另一方面糖基化的生长因子可以与修复细胞表面糖基化产物受体RAGE结合，进而导致糖尿病局部创面迟发但持续的慢性炎症，并改变修复细胞的合成分泌功能及增殖活性，导致溃疡面难以愈合〔7，8〕。

DF溃疡属中医“溃疡”、“脱疽”、“消渴”等范畴，中医学认为本病的发病机制主要是消渴日久，气阴两虚，经脉瘀阻，血行不畅，肢端失养，加之湿热下注，久之则肢端坏死。故治疗上应采用益气养阴，活血通络清热利湿的治疗方法，清利活血汤中黄芪、山药、生地益气养阴，当归桃仁、红花川芎养血活血，玄参、苍术、银花、黄连、土元、鱼腥草清热利湿，土鳖虫咸寒归肝经，有破瘀血、续筋骨功效，现代研究表明土鳖虫具有较好的降血糖、血脂作用〔9〕;三黄生肌纱条在我科临床应用多年，具有良好的清热活血生肌敛疮的作用，实验研究其可以提高局部创面血管内皮生长因子的作用〔10〕。内外相和，清利活血生肌敛疮，可较好地加速DF溃疡面的愈合。

1 梁丽荣，谭 岩，赵维彦，等.糖尿病足的病因分析及治疗进展〔J〕.中国老年学杂志，2009;29(2):381-3.

2 肖正华，张正军，周 倩，等.糖尿病足溃疡患者白介素-1β对成纤维细胞增殖及基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9的影响〔J〕.中国慢性病预防与控制，2008;16(6):581-3.

3 Dinh TL，Veves A.A review of the mechanisms implicated in the pathogenesis of the diabetic foot〔J〕.Int J Low Extrem Wounds，2005;4(1):154-9.

4 肖正华，周 倩，余绮珍，等.糖尿病足溃疡渗出液中IL-1β动态变化及黄芪提取液外敷治疗〔J〕.广州医学院学报，2008;36(6):11-4.

5 王 静，张秀娟，张秀敏.老年糖尿病血浆降钙素基因相关肽和内皮素测定的临床意义〔J〕.中国老年学杂志，2001;21(6):431.

6 李令根，李日恒，赵 钢，等.康脉3号胶囊对糖尿病足患者内皮素及一氧化氮的影响〔J〕.中国中西医结合外科杂志，2003;9(6):426-7.

7 Niu Y，Xie T，Ge K，et al.Effects of extracellular matrix glycosylation on proliferation and apoptosis of human dermal fibroblasts via the receptor for advanced glycosylated end products〔J〕.Am J Dermatopathol，2008;30(4):344-51.

8 Lohwasser C，Neureiter D，Weigle B，et al.The receptor for advanced glycation end products is highly expressed in the skin and upregulated by advanced glycation end products and tumor necrosis factor-alpha〔J〕.J Invest Dermatol，2006;126(2):291-9.

9 张 晶，许贵香.土鳖虫对2型糖尿病大鼠模型血糖、血脂的影响〔J〕.第四军医大学学报，2009;30(5):465-7.

10 王晓媛，张雅兰，王自辉，等.中西医治疗对糖尿病足局部组织中细胞因子表达的影响〔J〕.四川中医，2010;28(12):93-5.