雷帕霉素对p70S6K-siRNA转染的EC9706细胞增殖的影响*

鲁照明，杨 帅，周媛媛，贝维娟，侯桂琴

郑州大学药学院 郑州 450001

雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于磷酸肌醇激酶相关蛋白激酶家族(phosphoinositide kinase-related kinase，PIKK)，是近年来发现的一种进化上保守的蛋白激酶，也是一种重要的信号转导分子，参与多种病理和生理过程，是细胞生长的中心调控因子[1-2]。许多研究[3-5]证明，mTOR有望成为肿瘤治疗中重要且有前景的分子靶点，其抑制剂如雷帕霉素及其衍生物目前正在许多肿瘤中进行临床前及临床研究，如宫颈癌、乳癌、肾细胞癌、结肠癌、前列腺癌及小细胞肺癌等。核糖体蛋白S6激酶 (ribosomal protein S6 kinase，p70S6K)是mTOR最重要的底物之一，被mTOR磷酸化的p70S6K(p-p70S6K)控制含5’Top结构的mRNA的翻译起始，是蛋白合成中重要的调控因子[6]。食管鳞状细胞癌(简称食管鳞癌)是世界六大常见肿瘤之一，恶性程度高，5 a存活率低于5%[7]，在发展中国家尤为常见。作者以p70S6K特异性小片段干扰RNA (p70S6K-siRNA) 转染人食管鳞癌EC9706细胞，分析转染前后雷帕霉素对细胞增殖的影响，为人食管鳞癌的基因治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1细胞株与试剂EC9706购自上海中科院细胞库，胰蛋白酶和BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所，RPMI 1640培养基和标准胎牛血清购自美国Hyclone公司，雷帕霉素购自美国Sigma公司，LipofectamineTM2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒购自美国Thermo Fisher公司，Taq酶、dNTP和DNA Marker购自大连宝生物公司，对照siRNA(无义对照siRNA)、p70S6K-siRNA、HRP标记羊抗兔IgG及GAPDH抗体、p70S6K(C-18)抗体及p-p70S6K(Thr421/Ser424)兔抗人多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司。p70S6K上游引物：5’-ATGCTGCTTCTCGTCT GG-3’，下游引物：5’-TTGAGTCATCTGGGCTGT-3’，扩增产物长度为204 bp；内参GAPDH上游引物：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAA-3’，下游引物：5’-AG GTCCACCACTGACACGTTG-3’，扩增产物长度为570 bp。引物由上海捷瑞公司合成。

1.2细胞培养与转染EC9706细胞用含体积分数10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养液，于37 ℃、体积分数5%CO2条件下培养。取对数生长期的细胞用于实验。细胞以1×105个/孔接种在6孔板中，加RPMI 1640培养液培养过夜。当细胞融合度达到80%～90%时，按LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书将p70S6K-siRNA转染细胞，并于转染48 h后在荧光显微镜下进行RNA干扰效率的检测，同时用未转染和转染对照siRNA的细胞作对照。

1.3各组细胞p70S6KmRNA的检测分别提取转染对照siRNA 48 h的EC9706细胞、转染p70S6K-siRNA 24、48 h的EC9706细胞及未转染的EC9706细胞总RNA，反转录成cDNA，RT-PCR检测p70S6K mRNA。PCR反应体系25 μL，其中cDNA 0.5 μL，上、下游引物各0.25 μL，Taq酶0.2 μL，dNTP 2 μL，10×buffer 2.5 μL。扩增条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 30个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃终止。反应结束后取p70S6K和GAPDH的PCR产物各10 μL进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。实验重复3次。以p70S6K与GAPDH条带灰度值的比值表示p70S6K mRNA的相对表达量。

1.4各组细胞p70S6K蛋白的检测分别收集转染p70S6K-siRNA 24、48 h的EC9706细胞，提取总蛋白，以未转染的EC9706细胞为对照。蛋白上样量均为30 μg。p70S6K及p-p70S6K一抗分别按1500和1600稀释，二抗均按110 000稀释。转膜条件为：半干转膜，12 mA，1 h。50 g/L脱脂奶粉PBST溶液室温下振摇封闭2 h，加一抗后4 ℃过夜。次日PBST洗3次，5 min/次，然后加二抗室温下振摇2 h，再用PBST洗3次，5 min/次，ECL发光液孵育2 min，曝光。实验重复3次。以p70S6K或p-p70S6K与GAPDH条带灰度值的比值表示p70S6K或p-p70S6K蛋白的相对表达量。

1.5各组细胞细胞存活率测定收集转染24 h和未转染的EC9706细胞，分别接种于96孔板，每个样本设3个复孔，细胞贴壁后，加入不同浓度的雷帕霉素(0、25、50、100、150、250、500、1 500 nmol/L)继续培养48 h；每孔加入5 g/L MTT 20 μL，继续培养4 h后在自动酶标仪上测定波长490 nm处各孔吸光度(A)值。细胞存活率=实验组A值/空白对照组A值×100%。

1.6统计学处理应用SPSS 17.0处理数据。采用单因素方差分析比较各组细胞p70S6K mRNA和蛋白表达的差异，两两比较采用SNK-q检验，采用2×8析因设计的方差分析比较转染和未转染组细胞存活率的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1细胞转染效率细胞转染对照siRNA 48 h后，在荧光显微镜(×200)下可见明显绿色荧光，转染效率可达95%以上，提示对照siRNA能顺利转染进入细胞，故认为同等条件下p70S6K-siRNA也能转染进入细胞。

2.2p70S6K-siRNA对EC9706细胞p70S6KmRNA表达的影响见图1。未转染组、转染对照siRNA组、转染p70S6K-siRNA 24 h组和48 h组p70S6K mRNA的相对表达量分别为(2.00±0.28)、(1.40±0.17)、(0.64±0.09)和(0.32±0.06)，4组间差异具有统计学意义(F=57.825，P<0.01)；转染p70S6K-siRNA的EC9706细胞中p70S6K mRNA表达较其他组下降，且转染时间长者其表达更低(P<0.05)。

2.3p70S6K-siRNA对EC9706细胞p70S6K及p-p70S6K蛋白表达的影响与未转染组比较，转染p70S6K-siRNA的EC9706细胞中p70S6K及p-p70S6K蛋白的表达降低。见图2、表1。

图1 各组细胞中p70S6K mRNA的表达

图2 各组细胞中p70S6K及p-p70S6K蛋白的表达

表1 各组细胞中 p70S6K和p-p70S6K蛋白的表达比较 (n=3)

*：与未转染组相比，P<0.05。

2.4雷帕霉素对p70S6K-siRNA转染的EC9706细胞增殖的影响转染后细胞对雷帕霉素的敏感性增加。见表2。

表2 雷帕霉素作用后各组EC9706细胞存活率的比较 (n=3) %

F组间=1 958.000，F剂量=664.919，F交互=55.184，P均<0.001。

3 讨论

肿瘤的形成是一个多步骤、多因素影响的过程，发病的原因很多，癌基因的激活、信号通路的异常等都会导致肿瘤的发生，应用RNA干扰对肿瘤基因进行沉默抑制，从而为肿瘤的研究及治疗寻找新的途径已经引起人们的广泛关注。Matsubara等[8]观察到利用siRNA干扰mTOR的表达后，非小细胞肺癌细胞增殖减慢，凋亡增加，细胞迁移受到抑制。Jin等[9]观察到沉默Twist1基因，激活LKB1/AMPK/mTOR通路，下调mTOR/S6K1活性，降低Mcl-1蛋白的表达，可促进非小细胞肺癌细胞对顺铂的敏感性。张威等[10]干扰EC9706细胞中mTOR的表达，最终抑制了EC9706细胞的增殖并促进其凋亡。

食管鳞癌是最常见的恶性肿瘤之一，现存的治疗方法还不能对其进行很好的治疗。已有报道[11-13]证实PI3K/AKT/mTOR通路的异常激活与很多肿瘤的发生发展密切相关。mTOR通路在EC9706细胞中异常激活，mTOR抑制剂雷帕霉素在体内外均可抑制食管鳞癌细胞的生长[14-15]。由于 mTOR分子较大(相对分子质量为289 000)，与其作用的蛋白也较多，而p70S6K作为mTOR下游最重要的靶点之一，第389位苏氨酸可直接被mTOR磷酸化，p-p70S6K可以促进延长因子-1a、poly(A)结合蛋白等蛋白的翻译及表达[16]。因此，作者认为用siRNA下调p70S6K的表达，可导致细胞对雷帕霉素更加敏感。在检测p70S6K-siRNA对p70S6K mRNA的干扰效果时，作者同时转染对照siRNA，发现其对p70S6K无明显干扰效果，因此在检测其对p70S6K蛋白表达的影响时未设此对照。该实验数据显示，干扰后p70S6K mRNA的表达及其蛋白的磷酸化水平明显减低，且雷帕霉素对细胞增殖的抑制作用更加明显，说明干扰p70S6K表达后EC9706细胞对雷帕霉素敏感性增强。该研究可能为食管鳞癌的分子治疗提供实验依据。

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