基于酪氨酸酶的丝素蛋白膜的制备及其性能

李新玥，邢铁玲

(苏州大学纺织与服装工程学院，江苏苏州215021)

丝素蛋白具有良好的绿色环保性能，一直是人们研究的热点。早期的丝素蛋白主要用于食品添加剂和化妆品中［1］。在目前的研究中，丝素蛋白由于与生俱来的无毒性、无刺激性，优良的生物相容性和可降解性等优势，常被用于制备人工皮肤、人工骨骼、酶固定化材料、药物缓释载体、抗血凝性材料、细胞培养基质等生物医用材料的重要可选原料［2］。

丝素蛋白溶液直接经一般条件烘干、静电纺或冷冻干燥等方法制得膜、无纺网和多孔支架等不同形态的材料，其聚集态结构多以无规卷曲为主，分子间的结合力较弱，在水中溶失率大，限制了丝素蛋白材料的应用［3］。当前多采用各种物理和化学方法制备共混的丝素膜，从而得到耐水性好的材料。

酪氨酸酶(Tyrosinase)是一种含铜的金属酶，广泛分布于微生物、动植物及人体中，它具有双重的生物催化作用，既有单酚酶活性又有二酚酶活性，既能催化单酚类化合物生成邻苯二酚，又能氧化邻苯二酚脱氢生成邻苯醌，能将酪氨酸羟化，产生L-多巴，然后再将多巴氧化成多巴醌，进而生成一系列引起褐化的色素类物质［4］。

丝素蛋白中含有18种氨基酸，其中酪氨酸、丝氨酸、谷氨酸和酪氨酸等约占氨基酸总量的30%。将酪氨酸酶引入到丝素蛋白体系中，它能催化其中的酪氨酸发生酶促氧化反应，使得蛋白质分子之间发生交联［5-6］。基于这样的反应原理，用酪氨酸酶作为交联试剂，加入到丝素蛋白溶液中，在一定的条件下制成溶失率较低的交联丝素膜。与现有的添加化学交联剂成膜，如添加聚乙二醇缩水甘油醚形成不溶于水的丝素膜相比［7］，本研究具有生态、环保的优势。

1 实验材料与方法

1.1 材料与仪器

实验材料:桑蚕丝(江苏苏豪国际集团股份有限公司)，酪氨酸酶(Sigma)，无水碳酸钠，溴化锂，透析袋。

实验仪器:MP516型溶解氧分析仪(上海三信仪表厂)，TU-1810紫外/可见分光光度计(北京普析有限责任公司)，美国Instron3365万能材料试验机、YG(B)141D数字式织物厚度仪(温州市大荣纺织仪器有限公司)。

1.2 丝素溶液的制备

家蚕生丝用无水碳酸钠完全脱胶，经充分烘干后用9.3 mol/L的溴化锂溶液溶解(60℃ ×30 min)，经透析、过滤之后得到丝素溶液，用称重法计算丝素溶液的含固率。

1.3 丝素膜的制备

按照一定的比例将酪氨酸酶加入到丝素蛋白溶液中，在一定的工艺条件下反应，反应结束后将溶液置于准备好的盒子中风干，制得丝素膜。

2 实验测试

2.1 酶促反应的溶解氧分析

用MP516型溶解氧分析仪在一定的条件下测试酶促反应体系溶解氧的变化情况。

2.2 丝素蛋白溶液吸光度测试

用紫外/可见光分光光度计在200～400 nm测定不同条件下丝素溶液的吸光度，并优化出最佳的反应工艺。

2.3 丝素膜的理化性能测试

2.3.1 含水率

将丝素膜在恒温恒湿(25℃，相对湿度65%)下平衡24 h，每个称取质量w1(g)的样品3块，然后在烘箱中105℃烘至恒重，称量得到w2(g)。则根据公式(1)计算出含水率。

2.3.2 溶失率

将丝素膜在同一室温条件下平衡24 h，然后称取w3(g)，放入编过号的锥形瓶中，按浴比1︰100加入去离子水，在37℃的水浴恒温震荡器中预热30 min后震荡24 h，然后取出溶液。溶液离心后取上层清液，用紫外分光光度计测出各溶液在275 nm下的吸光度并记录。由测出的吸光度，根据公式计算出溶解的丝素重量，即可得出丝素膜的蛋白溶失率。

式中:C为丝素蛋白溶失率，%;K为丝素溶液的紫外吸光常数，mL/g;A为吸光度;V为溶液体积，mL;w3为样重品质量，g。

2.3.3 力学性能

将丝素膜剪成60 mm×10 mm的长条状，编号后测定每个样片的厚度。于恒温恒湿(25℃，相对湿度65%)下平衡24 h后在Instron3365万能材料试验机上进行拉伸测试，夹距为20 mm，拉伸速度为20 mm/min。按公式计算膜的断裂强度。

式中:P为膜的断裂强度，MPa;F为膜的断裂强力，N;d为膜的宽度，mm;h为膜的厚度，mm。

按公式计算膜的初始模量。

式中:E0为初始模量，MPa;Pa为拉伸负荷，N;l0为试样的夹持长度，mm;Δla为试样伸长值，mm;S为试样横截面积，mm2。

2.4 氨基酸分析

将待测丝素膜试样置于水解管中，加入6.0 mol/L HCl溶液，与110℃下密封水解24 h，过滤，蒸干;再加入0.02 mol/L的HCl溶液，在真空中放置30 min，采用Hitachi 835-50氨基酸自动分析仪测定除色氨酸以外的其他氨基酸的质量分数。

2.5 X射线衍射分析

使用全自动X'PERT-PRO MPD射线衍射仪，CuKα射线，X射线波长:λ=1.5406Å计数器:超能探测计数器，记录得到丝素膜2θ=5°～50°的衍射强度曲线。

3 结果与讨论

3.1 酶促反应的溶解氧分析

图1为酪氨酸酶催化丝素蛋白上L-酪氨酸发生反应的原理式，该反应需要在氧气存在的情况下才能正常进行［8］，如果不及时给反应浴补充氧气，反应浴中的氧气会逐渐减少。改变交联反应的温度，采用溶解氧分析仪对密闭的丝素溶液体系的溶解氧进行测试。测试结果如图2所示，其溶解氧变化曲线可分为3个阶段。反应前10 min，反应浴内的溶解氧含量充足，主要进行有氧反应，生成L-多巴和多巴醌。当反应进行到30 min左右时，体系内溶解氧含量逐渐降低，有氧反应和不需氧气的迈克尔加成反应同时进行，并且达到一个相对平衡，所以在这一个阶段氧气消耗量趋于平缓。在最后一个反应阶段，随着反应进行，体系内溶解氧逐渐消耗而且没有新的氧气补充进来，体系内的氧气逐渐消耗，直至被消耗完反应结束［9］。

图1 酪氨酸酶对丝素蛋白的催化反应Fig.1 Catalytic reaction of silk fibroin by tyrosinase

图2又可见，随着反应温度升高，体系内的溶解氧量消耗速度逐渐变快。当反应温度为25℃时，反应进行70 min时体系内的溶解氧量只发生较小变化;当温度升到45℃，反应进行到30 min时，体系内的溶解氧就降为零。即在同样的反应配比下，反应浴温度越高，酪氨酸酶越快发挥催化作用，使得酶促反应速率加快，反应浴内的氧气消耗也相应加快，使得溶解氧曲线产生了如图2所示的差异。因此，可以证明丝素上的酪氨酸残基确实被酪氨酸氧化。

图2 反应温度对酶促反应的溶解氧消耗的影响Fig.2 Effect of enzymatic reaction temperature on oxygen consumption

3.2 酶促反应条件对丝素溶液吸光度的影响

3.2.1 酪氨酸酶用量对丝素-酪氨酸酶溶液吸光度的影响

固定反应温度和反应时间，改变酪氨酸酶的用量，用紫外分光光度计在200～400 nm对反应后的溶液的吸光度进行测试。

丝素和酪氨酸酶在一定的温度和时间下反应，反应结束后，溶液由原来的无色透明变为红棕色，随着酶用量的增多这种变色更加明显。如图3所示，与空白的酪氨酸酶溶液和丝素溶液组对照，添加酪氨酸酶的溶液在340～360 nm的吸收显著增大，并且随着酪氨酸酶用量增加，吸光度逐渐增大，在350 nm出现了一个较宽的吸收峰。并且蛋白质在280 nm附近的吸收峰逐渐向300 nm移动。

如图1反应机理所示，酪氨酸酶催化丝素蛋白反应会生成L-多巴和多巴醌。有研究指出，酪氨酸酶催化丝素蛋白反应后生成的300 nm和360 nm吸收峰分别是L-多巴和多巴醌的吸收峰［9-11］。当底物浓度相同时，反应后溶液的红棕色越深，在340～360 nm的吸光度越大，则生成的L-多巴和多巴醌越多，即认为丝素蛋白的交联程度越高，所以在本组实验中4 000 U/g的酶量交联效果最好(即每克丝素蛋白需要4 000 U的酪氨酸酶，下同)。

对汾河流域节水灌溉发展水平的准确评价，是正确认识汾河流域节水灌溉发展水平、推动本区域节水灌溉发展的基础，是制定区域节水政策、方案和措施的科学依据。近年来，节水灌溉发展水平综合评价已经由最初的定性描述分析或定量数据比较发展到定性与定量相结合[1]，由依靠主要指标构建简单的评价体系发展到利用多指标或多目标构建综合评价体系。

图3 酪氨酸酶用量对丝素-酪氨酸酶溶液吸光度的影响Fig.3 Effect of tyrosinase dosage on absorption of silk-tyrosinase solution

3.2.2 反应温度对丝素-酪氨酸酶溶液吸光度的影响

固定酪氨酸酶用量和反应时间，改变反应温度，对反应后溶液的吸光度进行测试。从图4可以看出，改变反应温度后，溶液的吸光度发生较大变化。从25℃开始升高反应温度，反应后溶液的吸光度逐渐增大，当反应温度升高到60℃时，溶液的吸光度反而降低。

图4 反应温度对丝素-酪氨酸酶溶液吸光度的影响Fig.4 Effect of reaction temperature on absorption of silk-tyrosinase solution

反应温度通过影响酪氨酸酶的活性影响反应后溶液的吸光度值。在一定范围内，反应温度太低，酪氨酸酶活性释放较慢，反应需要很长时间;反应温度太高，酪氨酸酶存在失活的可能。当反应温度为25℃时酪氨酸酶缓慢释放活力，相同时间内催化交联的L-酪氨酸含量少，生成的L-多巴和多巴醌的量也相应较少，使得吸光度值也低。随着温度升高，酪氨酸酶活力释放速度增大，交联反应速率增大，生成较多的有色物质，吸光度值增大。但当温度升高到60℃时，酪氨酸酶存在失活的可能，而且酪氨酸酶在较短的时间内释放较多的酶活，一部分酪氨酸酶还没来得及发生催化交联就已经失去酶活，这对发挥酶的高效催化作用是不利的，导致最终反应后溶液呈现偏黄的棕色，吸光度值反而降低。综合以上分析，选择45℃为酶促反应的最佳温度。

3.2.3 反应时间对丝素-酪氨酸酶溶液吸光度的影响

固定酪氨酸酶用量和反应温度，改变反应时间，对反应后溶液的吸光度进行测试。从图5可以看出，随着反应时间延长，丝素溶液在350 nm附近的吸收峰逐渐抬高，并且峰形越来越明显。反应时间为0时，酶促反应并未开始，溶液在350 nm左右的吸光度值接近于0。随着反应时间延长，酶促反应生成的L-多巴和多巴醌的量逐渐积累，在350 nm附近的吸光度值逐渐增大。在反应的前120 min内，350 nm附近的吸光度值快速增大，继续延长反应时间，吸光度值有较小增大，但反应进行到120 min时继续延长时间，反应后溶液的颜色从红棕色向黄棕色变化，可能生成了其他更加复杂的催化产物，所以选定反应时间为120 min。

图5 反应时间对丝素-酪氨酸酶溶液吸光度的影响Fig.5 Effect of reaction time on absorption of silk-tyrosinase solution

3.2.4 空气和氧气对丝素-酪氨酸酶溶液吸光度的影响

从上述溶解氧分析中可知，在密闭条件下酪氨酸酶催化酪氨酸残基发生反应，体系内的氧气会逐渐消耗直至殆尽。通过给反应浴中通氧气和空气的方法给反应浴中补充氧气，用不通任何气体作为对照，对反应后溶液吸光度进行测试。如图6所示，通氧气的丝素溶液反应后在350 nm的吸光度值明显大于通空气和对照组的。

图6 空气和氧气对丝素-酪氨酸酶溶液吸光度的影响Fig.6 Effect of air and oxygen on absorption of silk-tyrosinase solution

3.3 丝素膜的溶失率和力学性能

在上述工艺条件下，改变酪氨酸酶的用量，用流延法制成丝素膜，并对所成丝素膜的溶失率膜的力学性能进行测试。如图7所示，纯丝素膜的溶失率为24%，随着酶用量增大，膜的溶失率逐渐降低，当酶用量增大到2 000 U/g时，膜的溶失率降到了11.2%，当酶用量继续增大到1︰4 000 U/g时，溶失率只有3.2%。断裂强度也有同样的变化趋势，在初始酶用量较少时，膜的断裂强度只有较小程度的提高，当酶用量增大到1︰2 000 U/g时，膜的断裂强度达到了最大值，但是当酶用量继续增大到1︰4 000 U/g时，膜的断裂强度反而降低。

图7 酪氨酸酶用量对丝素膜的溶失率和断裂强度的影响Fig.7 Effect of tyrosinase dosage on water solubility and rupture strength of SF membrane

当底物浓度相同时，一定范围内，随着酪氨酸酶用量的增多，酶促交联反应进行的更加充分，蛋白质之间交联程度更大，所以膜的溶失率和断裂强度逐渐改善。

表1为用不同量的酪氨酸酶交联丝素蛋白所成丝素膜的初始模量和断裂伸长率分析。随着酪氨酸酶用量增多，丝素膜的初始模量逐渐增大，当酪氨酸酶用量为4 000 U/g时，膜的初始模量迅速降低，几乎等同于未交联膜的初始模量。随着酪氨酸酶用量增多，膜的初始模量增大，可认为随着交联程度的增大，膜的断裂由原来的韧性断裂向脆性断裂转变。但当酶用量增大到一定程度之后对膜的交联没有更大的改善，使其初始模量降低。从断裂伸长率的数据可以看出，酪氨酸酶用量发生改变，膜的断裂延伸率几乎不发生变化。

表1 酪氨酸酶用量对丝素膜的初始模量和断裂伸长率的影响Tab.1 Effect of tyrosinase dosage on elongation and initial modulus of crosslinked SF membrane

综上所述可认为，酪氨酸酶对丝素蛋白的交联作用，较大程度地改善了膜的溶失率和断裂强度，但是膜的韧性有所降低。

3.4 丝素膜的氨基酸分析

交联与未交联丝素膜的氨基酸含量分析如表2中所示。交联反应对丝素膜中氨基酸的种类无影响，但对各种氨基酸的含量有较大影响。未交联丝素膜中酪氨酸的质量分数为8.41%，交联丝素膜中酪氨酸含量逐渐减少，并且随着酪氨酸酶用量增多，其中酪氨酸含量逐渐降低(当酪氨酸酶用量为4 000 U/g时，膜中的酪氨酸含量仅为6.36%)。

已知酪氨酸酶可以特定的催化酪氨酸发生氧化反应，在本研究中当丝素蛋白底物浓度不变时，在一定的范围内随着酪氨酸酶用量增多，酪氨酸发生催化氧化的机率增多，则有更多的酪氨酸参与氧化反应，最终使得其中酪氨酸含量减少。这一结果与上述研究相吻合，进一步验证了酪氨酸酶催化丝素蛋白中的酪氨酸，发生了氧化交联反应。

表2 丝素膜的氨基酸含量分析Tab.2 Amino acid composition of silk membrane %

3.5 丝素膜的X射线衍射分析

如图8所示，两种丝素膜在12.2°(Silk I)和9.1°(Silk II)均无明显吸收峰，说明纯丝素膜和酪氨酸酶催化交联丝素膜均以无归卷曲结构为主。只是丝素膜在20°的峰形稍为尖锐，这说明交联前后丝素膜的结晶结构没有发生明显变化。从膜的热水溶解性分析可知，交联后膜的热水溶失率明显降低，这说明在丝素蛋白结构聚集态结构未发生变化的情况下，丝素蛋白分子之间形成了交联，这种交联使丝素分子结构从线性向体型转变，从而使其不溶于水。X射线衍射结果进一步说明酪氨酸酶催化了丝素蛋白大分子的交联反应。

图8 丝素膜的X射线衍射分析Fig.8 X-ray diffraction curves of SF membrane

4 结论

通过交联前后丝素溶液吸光度的变化，优选出酪氨酸酶催化丝素蛋白溶液交联反应的最佳工艺为:酪氨酸酶用量4 000 U/g，反应温度45℃，反应时间120 min。并用流延法制得了交联丝素蛋白膜，对所成膜的24 h热水溶失率和膜的力学性能进行了测试，对照交联与未交联的丝素膜，膜的热水溶失率和力学性能有较大改善。膜的氨基酸含量分析结果表明交联前后丝素膜中的酪氨酸含量减少，证明酪氨酸酶可催化其发生反应。X射线衍射结果表明交联丝素膜仍以无规卷曲结构为主，与未经交联的丝素膜相比，聚集态结构无显著变化。综合以上分析可知，酪氨酸酶可以催化丝素大分子间的交联反应。

［1］CHERT K，UMEDA Y，HIRABAYASHI K.Enzymatic hydrolysis of silk fibroin［J］.J Seric Sci Jpn，1996，65(2):131-133.

［2］KIM U J，PARK J，KIM H J，et al.Three-dimensional aqueous-derived biomaterial scaffolds from silk fibroin［J］.Biomaterials，2005，26(15):2275-2785.

［3］焦宇虹，李明忠.蚕丝丝素蛋白材料交联方法的研究进展［J］.现代丝绸科学与技术，2011，26(6):242-246.JIAO Yuhong，LI Mingzhong.The study advance in the crosslinking method of silk fibroin［J］.Modern Silk Science＆Technology，2011，26(6):242-246.

［4］赵希荣，李松林.酪氨酸酶在壳聚糖生物改性中的应用［J］.化工进展，2011，30(11):2509-2515.ZHAO Xirong， LI Songlin. Application of tyrosinase in chitosan's modification［J］.Chemical Industry and Engineering Progress，2011，30(11):2509-2515.

［5］孙宝山，郭成勋.多酚氧化酶对蛋白质的修饰作用［J］.食品与发酵工业，1987(3):73-78.SUN Baoshan，GUO Chengxun.Polyphenol oxidase modifying function of protein［J］.Food and Fermentation Industries，1987(3):73-78.

［6］FAERGEMAND M，OTTE J，QVIST K B.Cross-linking of whey proteins by enzymatic oxidation［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1998，46(4):1326-1333.

［7］卢神州，李明忠，刘洋，等.聚乙二醇缩水甘油醚对丝素蛋白膜的改性［J］.高分子材料科学与工程，2001，19(1):104-107.LU Shenzhou，LI Mingzhong，LIU Yang，et al.Modification of silk fibroin membrane polyethylene glycol diglycidyl ether［J］.Polymer Materials Science ＆ Engineering，2001，19(1):104-107.

［8］王宁芳.酪氨酸酶的提取及其催化活性研究［J］.安徽农业科学，2009，37(20):9315-9316.WANG Ningfang.Research on the extraction of tyrosinase and determination of its catalytic activity ［J］.Journal of Anhui Agricultural Sciences，2009，37(20):9315-931.

［9］KANG G D，LEE K H，KI CS，et al.Crosslinking reaction of phenolic side chains in silk fibroin by tyrosinase［J］.Fibers and Polymers，2004，5(3):234-238.

［10］ANGHILERI A，LANTTOR，KRUUSK，et al.Tyrosinasecatalyzed grafting of sericin peptides onto chitosan and production of protein-polysaccharide bioconjugates［J］.Journal of Biotechnology，2007，127(3):508-519.

［11］KUBOE Y，TONEGAWA H，OHKAWA K .Quinone crosslinked polysaccharide hybrid fiber［J］.Biomacromolecules，2004，5(2):348-357.