低氧预适应对小鼠急性脑梗死缺血半暗带神经元凋亡的影响及机制研究

赵丽红， 林立文， 张颜波

低氧预适应(hypoxic preconditioning，HP)是一种机体内源性保护机制，其通过一系列复杂环节调动机体潜能减轻缺氧损伤，对机体起保护作用。脑梗死是神经系统的常见病和多发病，容易造成智能障碍和肢体残疾等症状，但缺乏特异性临床治疗方法或药物。如何将HP保护理论应用于临床疾病的治疗是目前国内外转化医学研究的热点和难点。我们既往实验已经初步证实，低氧预适应能改善急性脑梗死小鼠神经功能评分，减少急性脑梗死面积［1～10］。急性脑梗死缺血半暗带神经元功能的恢复，是提高患者预后的关键。Bcl-2、Bax和Caspase-3是神经元凋亡重要调节因子，故本实验拟观察低氧预适应对急性脑梗死小鼠缺血半暗带神经元凋亡的影响，应用激光共聚焦、免疫荧光等实验技术，检测Bcl-2、Bax和Caspase-3等凋亡因子，探索相关机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 立体定位仪(51600型，美国 Stoelting公司)、冰冻切片机(LEICA CM1900型，瑞士徕卡公司)、激光共聚焦显微镜(Radiance 2100型，美国 Bio-Red公司)、恒温培育箱(WGP-350，上海安亭科学仪器厂)、原位细胞凋亡检测试剂盒(美国Roche公司)、PBS(武汉博士德公司)、SABC-FITC免疫荧光检测试剂盒(武汉博士德公司)、兔抗鼠Bcl-2、Bax和Caspase-3抗体、羊抗兔多克隆二抗(SANTA CRUZ公司)、玫瑰红(美国Sigma公司)、冷光源 (LG-150型，徐州恒达光学电子仪器有限公司)、0.01mol/L PBS、多聚甲醛(SANTA CRUZ公司)。

1.2 实验动物 清洁级Balb/c近交系小鼠48只，6～8周龄，体质量18～22g，雌雄不拘，由首都医科大学动物部提供。数字随机表法分为4组:(1)正常对照组(N)，无任何处理;(2)假手术组(C)，仅行冷光源照射，不注射玫瑰红;(3)急性脑梗死组(CI)，光化学法诱导小鼠脑皮质梗死模型;(4)低氧预适应+急性脑梗死组(HP+CI)，低氧预适应后复制光化学法诱导小鼠脑皮质梗死模型，每组小鼠12只，共48只。

1.3 低氧预适应模型的复制［1～10］将低氧对照组、低氧预适应组小鼠放入一个125ml的广口瓶内，立即用橡皮塞封紧，以动物出现第1次喘呼吸为低氧耐受极限的标志，完成低氧暴露1次(H1);随即再将低氧预适应组小鼠移入新的广口瓶内、封闭，依此再重复操作3次(H4)，复制低氧预适应模型。正常对照组小鼠不进行低氧暴露。

1.4 光化学诱导小鼠脑皮质急性脑梗死模型的制作［4］室温 25℃条件下，腹腔注射水合氯醛0.35g/kg麻醉，经尾静脉缓慢注入100mg/kg的5%玫瑰红，立体定位仪固定小鼠头部，沿头正中切口分离、暴露左侧颅骨。以矢状缝左侧2mm、冠状缝后2mm为中心、直径3mm为照射野，使冷光源(150W、24V金属卤化灯为发光光源，光导纤维传送，滤去全部紫外线与红外线，投射出单一绿色光束，波长为530nm)光导纤维探头垂直贴近暴露的颅骨。注射玫瑰红后5min时打开冷光源，光照强度2Lx，照射10min后结束缝合头部皮肤，局部碘酒消毒。假手术组仅照射冷光源，未注射玫瑰红。

1.5 细胞凋亡检测 采用TUNEL法，在脑梗死模型复制后24h处死动物，取出脑梗死缺血半暗带脑组织，液氮速冻，行冰冻切片，片厚度约10μm;用新鲜配制的4%多聚甲醛溶液固定，室温30min;PBS洗片，滴加阻断剂(0.3%H2O2甲醇溶液)，室温孵育30min;PBS洗片，滴加通透液(0.1%Triton X-100溶于0.1%枸橼酸溶液)，冰浴中孵育2min;PBS洗2遍，擦干样品周围液体，滴加50μl TUNEL反应混合物，37℃湿盒中孵育60min;PBS洗片3次，1:1的甘油PBS溶液封片。应用Bio-Red Radiance 2100型激光扫描共聚焦显微镜操作系统的Ar单通道激光系统，扫描阳性反应物。扫描选用的参数为:激发光波长为488nm，观测光为518nm，物镜为40倍，扫描方式为点扫描，Zoom为1.0。经Lasersharp 2000软件摄像，每只动物分别随机观察并计数30个不同视野TUNEL阳性细胞数目，并计算平均值用于分析。

1.6 Bcl-2、Bax和 Caspase-3 FITC 免疫荧光检测 在脑梗死模型复制后24h死动物，取出脑梗死缺血半暗带脑组织，液氮速冻，行冰冻切片，片厚度约10μm。4%多聚甲醛固定30min，0.01mol/L PBS冲洗3次。滴加0.01mol/L PBS 1:10稀释的正常血清封闭液，室温20min，甩去多余液体。滴加0.01mol/L PBS 1:200稀释的兔抗鼠 Bcl-2、Bax和Caspase-3抗体，4℃过夜，0.01mol/L PBS 冲洗3 次。滴加0.01mol/L PBS 1:100稀释的羊抗兔多克隆抗体，37℃ 孵育 30min，0.01mol/L PBS冲洗 3次。滴加0.01mol/L PBS 1:100稀释的 SABC-FITC，37℃孵育30min，0.01mol/L PBS冲洗4次。然后滴加0.01mol/L PBS1:1稀释的甘油封片。应用Bio-Red Radiance 2100型激光扫描共聚焦显微镜操作系统的Ar离子激光系统，扫描FITC标记的阳性反应物。扫描选用的参数为:激发光波长为554nm，观测光为575nm，物镜为40倍，扫描方式为点扫描，Zoom 为(1.0)。经 Lasersharp 2000 软件(4.5.3)摄像分析。

1.7 统计学分析 所有荧光图片经Lasersharp 2000软件(4.5.3)处理后，每组随机选取30张行荧光强度和阳性细胞数测定，数据以χ±s表示，由第一、二作者采用SPSS 10.0软件包中的单因素方差分析(ANOVA)进行统计处理，P＜0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 各组神经元凋亡变化 荧光强度检测结果显示，TUNEL阳性细胞以绿色荧光表示。N组、C组切片偶见TUNEL阳性(绿色荧光)细胞，CI组、HP+CI组阳性细胞明显增多，差异有显著性意义(P＜0.01);HP+CI组与CI组相比，TUNEL染色阳性细胞明显减少(P＜0.01)(见图1、表1)。

2.2 各组Bcl-2表达荧光强度比较 Bcl-2蛋白主要位于神经细胞胞浆、核膜及突起中，在本实验中标记为绿色荧光。N组、C组切片仅见极少量免疫荧光表达，CI组可见Bcl-2免疫荧光强度增加，HP+CI组明显增加。HP+CI组与CI组比较，Bcl-2免疫荧光强度明显增加，有统计学意义，P＜0.01(见图2、表2)。

2.3 各组Bcl-2阳性细胞数比较 Bcl-2阳性细胞以绿色荧光表示，N组、C组切片偶见阳性细胞，CI组可见Bcl-2阳性细胞数增加，HP+CI组明显增加。HP+CI组与CI组比较，Bcl-2阳性细胞数明显增多，有统计学意义，P＜0.01(见图2、表2)。

2.4 各组Bax表达荧光强度比较 Bax蛋白主要表达于神经细胞胞浆、核膜及突起中，在本实验中标记为绿色荧光。N组、C组仅见少量星点状荧光，荧光强度极弱，HP+CI组免疫荧光强度增加，CI组明显增加。HP+CI组与CI组比较，Bax免疫荧光强度明显减少，有统计学意义，P＜0.01(见图3、表3)。

2.5 各组Bax阳性细胞数比较 N组、C组切片偶见阳性细胞，HP+CI组可见Bax阳性细胞数增加，CI组明显增加。HP+CI组与CI组比较，Bax阳性细胞数明显减少，有统计学意义，P＜0.01(见图3、表3)。

2.6 各组Bcl-2/Bax比值比较 各组Bcl-2和Bax阳性细胞数比值发现，N组和C组相比，无明显差异，P＞0.05;CI组与 N组、C组相比，Bcl-2/Bax比值明显减少，P＜0.05;HP+CI组与N组、C组相比，Bcl-2/Bax比值明显增加，P＜0.01;HP+CI组与CI组相比，Bcl-2/Bax比值明显增加，P ＜0.01(见表4)。

2.7 各组 Caspase-3表达荧光强度比较 N组、C组切片仅见极少量免疫荧光表达，HP+CI组可见Caspase-3免疫荧光强度增加，CI组明显增加。HP+CI组与CI组比较，Caspase-3免疫荧光强度明显减少，有统计学意义，P＜0.01(见图4、表5)。

2.8 各组Caspase-3阳性细胞数比较 N组、C组切片偶见阳性细胞，HP+CI组可见Caspase-3阳性细胞数增加，CI组明显增加。HP+CI组与CI组比较，Caspase-3阳性细胞数明显减少，有统计学意义，P ＜0.01(见图4、表5)。

表1 各组凋亡神经元比较(χ ± s，n=6)

表2 各组Bcl-2表达荧光强度、阳性细胞数比较(荧光强度，χ ± s，n=6)

表3 各组Bax表达荧光强度、阳性细胞数比较(荧光强度，χ ± s，n=6)

表4 各组Bcl-2/Bax比值比较

表5 各组Caspase-3表达荧光强度、阳性细胞数比较(荧光强度，χ ± s，n=6)

3 讨论

本实验研究低氧预适应对急性脑梗死缺血半暗带神经元凋亡的影响，既是低氧预适应理论临床应用研究，又与传统脑缺血损伤治疗方法不同，侧重于调动组织细胞的一系列潜在的抗/耐低氧潜能和机制，从而获得在低氧条件下保持机体组织细胞生命活动的能力。我们实验室应用行为学、生理学、形态学、神经化学和分子生物学等多学科技术，对低氧预适应的效应与机制进行了一系列系统的研究并已作出了基本的概括［1～10］。随着对HP发生发展机制的认识，将有助于临床寻找防治缺血/缺氧性脑损伤的有效手段或药物靶分子的研发。众所周之，急性缺血性脑卒中是临床常见的急重症之一，死亡率高，致残危险性大，抢救急性脑梗死致脑缺血性损伤是其治疗的关键，积极寻找脑缺血性损伤保护方法或药物是研究的热点或难点问题［11～17］。我们既往研究发现:低氧预适应脑保护机制应用到脑梗死临床治疗研究中，从脑梗死体积测定、神经功能评定二个方面研究发现，低氧预适应能明显减少脑梗死面积，神经功能评分明显增加，所以低氧预适应能减少小鼠急性脑梗死体积、降低神经功能评分，从而发挥脑梗死致缺血性损伤的保护作用［7］，但这种保护作用机制尚不明确。

Bcl-2、Bax和Caspase-3分别是调节细胞凋亡两个分子家族中重要的成员，特别是在调节脑细胞凋亡中已经得到广泛证实。在众多凋亡调节基因中，Bcl-2家族中的Bcl-2和Bax的作用已得到广泛证实，被认为是细胞凋亡最后共同通路之一。细胞受到缺血/缺氧损伤时首先启动Bcl-2基因表达以抑制细胞凋亡，Bcl-2为 Caspase-3上游调控机制，Caspase-3则是引起凋亡的始发因子，Bcl-2的过量表达能有效地抑制Caspase-3的激活和细胞凋亡。正常情况下，Caspase-3以休眠状态的酶原形式存在于正常细胞中，可经线粒体依赖途径和细胞表面死亡区包含的受体两条不同途径激活，活化后的Caspase-3可以切割许多蛋白质底物，引起“瀑布式”的级联反应，最终引起细胞凋亡［5，6］。

本实验发现，HP+CI组Bcl-2表达既显著高于CI组;相反 Bax、Caspase-3表达低于 CI组，说明低氧预适应既能增加凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达又能抑制凋亡促进因子Bax、Caspase-3的表达，维持线粒体结构和功能稳定性，提高神经元缺氧耐受性，抑制细胞凋亡的启动和凋亡进程的发展，从而抑制急性脑梗死缺血半暗带神经元细胞的凋亡，维持神经元结构，提高细胞的耐缺氧能力，这为我们之前HP研究中观察到的HP能减少缺氧后细胞凋亡和坏死形态学改变，减轻动物整体缺氧缺血后神经功能损伤提供了证据［1～10］。低氧预适应理论应用是目前研究的热点和难点，低氧预适应理论在急性脑梗死中作用已有初步研究，相关机制也在探讨中。本实验从细胞凋亡及其机制方面进行研究，李俊发等也研究发现，应用小鼠整体低氧预适应和大脑中动脉组塞(MCAO)实验模型，研究低氧预适应对MCAO所致缺血性损伤的影响，从新奇型蛋白激酶C(nPKC)膜转位的变化、脑衰蛋白反应调节蛋白-2(CRMP-2)磷酸化水平、丝裂原和应激激活蛋白激酶1(MSK-1)及cAMP反应元件结合蛋白(CREB)磷酸化水平等方面，探讨相应保护机制［18～20］。研究发现:HP可在一定程度上缓解MCAO小鼠的行为学改变，减少梗死区梗死面积、缺血区吸光度值和水肿率;进一步机制研究发现，HP能缓解梗死区nPKC膜转位水平的降低;缓解小鼠脑缺血皮质缺血核心区内CRMP-2磷酸化水平的降低和减少皮质缺血半影区内CRMP-2水解片段;提高缺血半影区内MSK-1及其底物CREB的磷酸化水平，参与MCAO脑损伤脑保护机制。与本实验相比较，都明确肯定HP对急性脑梗死脑损伤的保护作用，不同之处在于从不同机制方面进行研究。总之，低氧预适应对急性脑梗死缺血半暗带神经元具有抗凋亡作用，与增加凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达又能抑制凋亡促进因子Bax、Caspase-3的表达机制有关。

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图1 各组凋亡细胞免疫荧光染色(×40)

图2 各组缺血半暗带神经元Bcl-2 FITC染色(×40)

图3 各组缺血半暗带神经元Bax FITC染色(×40)

图4 各组缺血半暗带神经元Caspase-3 FITC染色(×40)

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