OVCAR细胞转染miR-130b下调多梳基因-1蛋白表达增加对卡铂敏感性

林 琳，程晓东，傅真富

(1.浙江大学校医院妇科，浙江杭州 310058;2.浙江大学医学院附属妇产科医院，浙江杭州 310006;3.浙江省肿瘤医院，浙江杭州 310022)

卵巢癌是严重威胁妇女健康的恶性肿瘤之一，其早期诊断比较困难，大约75%的患者诊断时已处于中晚期，所以化学治疗是卵巢癌的主要手段，虽然近年来化疗方案的不断改进，但其5年生存率却一直徘徊在25%～30%，原发性或继发性耐药是其化疗成功的主要阻碍[1－2]。微小 RNA(microRNA，miRNA)是近年来发现的一类长17～25个核苷酸的内源性非编码小RNA，其与靶点mRNA的非翻译区域 (untranslated regions，3'UTR)区结合，诱导靶mRNA的降解或抑制翻译[3]。miRNA是目前已知的最大一类调节基因，其在细胞的生长、增殖、分化、凋亡和个体的发育中发挥着重要作用，最近的研究表明，miRNA参与了许多癌症的发生发展[4]，例如miR-21，miR-155，miR-373等发挥着癌基因的作用，而 miR-148a，let-7，miR-15a，miR-143，miR-34，miR-16等发挥着抑癌基因作用，并且最近已有 miRNA 用 于 治 疗 恶 性 肿 瘤 的 报 道[5－6]。miR-130b是一个新发现的miRNA，已有研究显示其通过调节抑癌基因RUNX3的活性抑制胃癌的发生[7]，并且在卵巢癌细胞中干扰miR-130b表达可以诱导细胞的耐药[8]。

多梳基因-1(Bmi-1)为多梳组基因(polycomb group genes，PcG)家族成员之一，是近年来新发现的一个癌基因，参与鼻咽癌、乳腺癌、肺癌和膀胱癌等多种人类肿瘤的发生和发展，Bmi-1主要是下调细胞周期的抑制基因p16和p19表达，加速细胞G1/S期的过渡，从而导致细胞恶性克隆性增生[9－10]。

本研究观察了卵巢癌OVCAR细胞转染miR-130b基因片段后卡铂对其敏感性的改变，并探讨了转染miR-130b基因片段对Bmi-1蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂及主要仪器

卵巢癌OVCAR细胞购于美国ATCC细胞库。青霉素、链霉素、四甲基偶氮唑蓝(MTT)和卡铂为美国Sigma公司产品，胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司，Lipofectiamine 2000购自广州英韦创津公司，Trizol购自分子探针公司，逆转录试剂盒购自大连宝生物公司，miRNA荧光定量PCR检测试剂盒购自北京普博辛生物科技有限公司，miR-130b和内参U6引物、miR-130b模拟物以及阴性对照由上海吉玛制药技术有限公司合成，Bmi-1、GAPDH抗体和HRP标记的兔抗鼠二抗购自美国Santa Cruz公司。7100荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品。

1.2 细胞培养

人卵巢癌上皮OVCAR细胞培养于含10%胎牛血清、青霉素 100 kU·L－1及链霉素 100 kU·L－1的RPMI 1640培养液中，培养条件为37℃，5%CO2。

1.3 细胞RNA转染实验

OVCAR细胞接种于6孔板，细胞达到70%～80% 融合时，按照Lipofectiamine 2000转染试剂盒说明书进行基因转染实验。化学合成的miR-130b模拟物:5'-UCAAUUUGCAUUUCGAAGUUU-3'，阴性对照为:5'-UUCGUCAUACGGCCUUAUACU-3';48 h后收集细胞提取总RNA，进行干扰效果的鉴定和相应的实验。

1.4 细胞总RNA的提取及RT-PCR

收集细胞，每5×105～1×106个细胞加入1 ml Trizol，按照Trizol说明书操作，提取细胞总 RNA，按照逆转录试剂盒说明书逆转录出cDNA第一链，用于后续的荧光定量PCR检测。

1.5 荧光定量PCR扩增检测miR-130b的表达

按照试剂盒说明书加入Q-PCR混合物、引物，置入7100荧光定量PCR仪反应。miR-130b正义引物:5'-CTCGGCAGTCAGGCGT-3'，反义引物:5'-GTCTCCGTCGCTTTCAGACGAT-3';内参照U6正义引物:5'-CTCGTTCGGCAGCACA-3'，反义引物:5'-AACGCTTCACAATGTGCGT-3'。扩增反应条件:94℃预变性15 s，95℃ 30 s，60℃ 15 s扩增40个循环，最后72℃延伸30 s。待测miRNA的表达量用2－△Ct表示，△Ct值=目的基因Ct值－内参基因 Ct值[5]。

1.6 MTT检测细胞存活

将处于对数生长期的正常对照组、miR-130b模拟物转染组和阴性对照组OVCAR细胞分别接种到96孔板，12 h后加入对倍系列稀释的卡铂(100，50，25，12.5，6.25，3.12，1.56 和 0.78 μmol·L－1)作用68 h。不同处理的 OVCAR细胞，加入 20 μl MTT 0.5 g·L－1孵育 4 h，100 μl DMSO 溶解结晶，酶标仪570 nm波长处测定吸光度(A)值，计算细胞存活抑制率(%)=(1－A用药组/A对照组)×100%。每个浓度设3个复孔，实验重复3次。参照肖建初等[11]的方法使用 Bliss法计算半数抑制浓度(IC50值)。

1.7 Western印迹法检测多梳基因-1蛋白的表达

收集正常对照组、miR-130b模拟物转染组和阴性对照组OVCAR细胞，PBS洗涤2次，1×SDS上样缓冲液裂解细胞，95℃ 10 min，12000×g离心10 min，取上清，8%～12%SDS-PAGE 胶电泳2 h，电转移蛋白至PVDF膜，将PVDF膜浸润在含5%脱脂奶粉的TBST中1 h，加入特异性一抗4℃过夜，加入HRP标记的二抗室温孵育1 h，最后加入发光底物X线曝光显示目的蛋白条带。蛋白条带使用美国Bio-Rad公司生产的QuantityOne软件进行积分吸光度(IA)值分析，以目标蛋白与内标的IA比值表示蛋白的相对表达量。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 OVCAR细胞转染miR-130b模拟物鉴定

荧光定量 PCR结果显示，正常对照组、miR-130b模拟物转染组和阴性对照组miR-130b表达的相对值分别为 0.22±0.08，0.46±0.12和0.23±0.10，miR-130b 模拟物转染组miR-130b表达显著高于正常对照组和阴性组(P＜0.01)，正常对照组和阴性组之间无统计学差异。说明转染miR-130b模拟物的OVCAR细胞中miR-130b表达显著增加，转染成功。

2.2 转染miR-130b模拟物对OVCAR细胞存活的影响

MTT实验结果显示(图 1)，正常对照组、miR-130b模拟物转染组和阴性对照组卡铂对卵巢癌 OVCAR 细胞的 IC50值分别为 32.4±4.6，14.7±2.1和(31.4±4.2)μmo·lL－1，miR-130b模拟物转染组显著低于正常对照组和阴性对照组(P＜0.01)，说明上调miR-130b后可以显著增加卡铂对OVCAR细胞的敏感性，其敏感性约增加了2.21 倍。

2.3 转染miR-130b模拟物对OVCAR细胞Bmi-1蛋白表达的影响

图2结果显示，正常对照组、miR-130b模拟物转染组和阴性对照组Bmi-1蛋白条带的IA值分别为0.75±0.16，0.21±0.12 和 0.77±0.18;与正常对照组相比，miR-130b模拟物转染组Bmi-1蛋白的表达出现显著降低(P＜0.01)，而阴性对照组 Bmi-1蛋白的表达则无显著性改变。

Fig.1 Effectofmimic/miR-130b tranfection on OVCAR cell survival treated with carboplatin 0.78 －100 μ mol·L －1for 68 h by MTT assay.

Fig.2 Effect of miR-130b tranfection on expression of Bmi-1 by Western blotting.Lane 1:normal control cells;lane 2:mimic/miR-130b trasfected cells;lane 3:negative/miR-130b trasfected cells.

3 讨论

miRNA模拟物是新近研发的一种可以刺激相应靶miRNA过表达的化学合成物，目前已广泛用于miRNA的过表达研究，给miRNA的功能研究带来了极大的方便[12]。本研究中荧光定量PCR结果显示，所使用的miR-130b模拟物可以成功上调miR-130b的表达，在miR-130b高表达的状态下，检测了卡铂对卵巢癌OVCAR细胞的敏感性，结果显示，miR-130b高表达可以显著增加卡铂对OVCAR细胞的毒性。化疗是卵巢癌的主要治疗方法之一，但是化疗药物的细胞毒性和耐药性则是成功化疗的主要障碍。上述结果提示，化疗时联用miR-130b有可能减少卡铂的用量或者克服卡铂的耐药。

进一步的研究显示，miR-130b模拟物转染组OVCAR细胞的Bmi-1蛋白出现了显著的降低。已有研究显示，Bmi-1在卵巢上皮性肿瘤中高表达，并且与淋巴结转移及预后密切相关，是卵巢癌患者独立的预后指标，并且细胞学实验结果也显示了基因沉默 Bmi-1后，可以显著抑制卵巢癌细胞的生长[13－14]。由此推测，高表达的 miR-130b 可能是通过下调Bmi-1的表达增加了卡铂对卵巢癌OVCAR细胞的敏感性，具体miR-130b调控Bmi-1的机制还有待进一步的研究来阐明。另外，本研究仅仅是在细胞水平完成的实验，在体内能否可以达到相似的效果，还有待进一步的裸鼠移植瘤实验来证实。

综上所述，高表达miR-130b可以增加卡铂对卵巢癌细胞的敏感性，下调Bmi-1蛋白表达可能是其增敏作用的主要机制，提示miR-130b有望成为克服卵巢癌铂类耐药的新靶点。

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