豹皮樟总黄酮体外对酒精性脂肪肝大鼠肝细胞脂肪变性的影响

胡成穆，曹 琦，解雪峰，刘洪峰，丁 琦，李 俊

(安徽医科大学药学院安徽天然药物活性研究省级实验室，安徽合肥 230032)

酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver，AFL)是因长期、大量饮用乙醇类饮料所致的肝细胞内脂质蓄积超过肝湿重5%的肝损害性疾病。乙醇本身具有热量，长期大量摄入，不仅损害脂肪氧化，还可刺激脂肪形成，引起脂质代谢紊乱。肝由多种细胞组成，肝细胞在AFL的形成中起着至关重要的作用，营养过剩或某种物质缺乏均可导致肝细胞损害[1]，而脂质在肝细胞内蓄积是所有肝疾病发病的先决条件[2]。

豹皮樟(Litsea coreana Leve)，又名老鹰茶，系樟科木姜子属毛豺皮樟的嫩梢和叶片，是我国南方各民族民间长期饮用的一种植物代用茶，具有清凉止渴和解毒消肿等功效。豹皮樟中含有多种活性成分，经本院天然药物化学教研室提取分离鉴定，确定了豹皮樟的有效部位为总黄酮，分别鉴定为槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷和山柰酚-3-O-β-D-半乳糖苷[3]，含量超过51.5%。前期研究表明，豹皮樟总黄酮 (total flavonoids of L.coreana Leve，TFLC)对AFL具有一定的保护作用[4]，为进一步探讨TFLC的作用机制，本研究以AFL大鼠肝灌流，分离培养肝细胞，观察TFLC对肝细胞脂质生成及脂肪分化相关蛋白(adipose differentiation-related protein，ADRP)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators activated receptor γ，PPARγ)表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物、药品、试剂和仪器

Sprague-Dawley(SD)大鼠，雄性，体质量160～200 g，安徽医科大学实验动物中心提供(普通级)，标准颗粒饲料喂养，合格证号:皖医实动准字第01号。TFLC由安徽医科大学药学院提取，使用时均研细后用无血清DMEM溶解后过滤灭菌;谷胱甘肽(glutathione，GSH)，上海源聚生物科技有限公司;DMEM培养基干粉，美国Gibco公司;Ⅳ型胶原酶和Trizol，美国Invitrogen公司;新生牛血清，杭州四季青公司;兔抗鼠ADRP多抗和鼠抗PPARγ单抗，美国Santa Cruz公司;HRP标记的羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG抗体，北京中杉金桥公司;丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)活性测定试剂盒，南京建成公司;甘油三酯(triglycerides，TG)含量测定试剂盒，北京福瑞生物工程公司;细胞角蛋白18(cytokeratin 18，CK18)抗体，北京博奥森公司;PCR逆转录试剂盒，美国 Promega公司。CO2恒温培养箱，美国Shellab公司;多功能显微镜，日本Olympus公司;PCR仪9700，美国ABI公司。

1.2 AFL大鼠模型的制备、肝灌流和肝细胞分离

大鼠正常饲养1周后，自由饮用乙醇饮料(含18%蔗糖)，其乙醇浓度从5%开始，每个浓度维持1周，依次增加为 10%，15%，20%，25%，30%，35%至40%，40%持续至第12周;正常对照组摄正常饮食12周。造模12周体质量为250～300 g的AFL大鼠6只，同期正常大鼠2只。按照Seglen的原位两步灌流法[5]并稍加改动分离肝细胞:大鼠禁食16 h，ip 10%水合氯醛麻醉，消毒，剖开腹腔，分离肝门静脉，插麻醉导管并结扎，分离下腔静脉插入另一根麻醉导管，灌注预温37℃不含Ca2+和Mg2+的Hank液，灌注至下腔静脉流出的液体变清时，开始灌注37℃预温消化酶(0.05%Ⅳ型胶原酶)，在位灌流待肝变软呈土黄色，表面呈现龟裂状，压之凹陷不易恢复，停止灌注。分离肝，移至超净台内用无菌镊撕开肝表面的包膜，抖落肝细胞，预冷的D-Hanks培养液制成肝细胞悬液，100目尼龙网筛滤去细胞团块及组织纤维，滤液4℃，34×g离心5 min，3次，完全DMEM(含10%血清)调整细胞浓度，制成5×108L－1的肝细胞悬液。

1.3 大鼠肝细胞的鉴定

CK18是成熟肝细胞的标志，可用于鉴定肝细胞。取灌流获取的肝细胞1×106L－1加入0.4%锥虫蓝(终浓度0.04%)，镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，活细胞拒染呈无色透明状。细胞爬片，肝细胞培养48 h，4%多聚甲醛固定，3%H2O2灭活内源性过氧化物酶，0.1%Triton X-100冰上破膜，血清封闭，一抗(兔抗大鼠CK18多克隆抗体1∶400)4℃过夜，二抗(HRP标记山羊抗兔 IgG抗体1∶800)37℃湿盒1 h(避光)，DAB显色，苏木素复染，脱水，封片。

1.4 MTT法测定肝细胞存活

调整肝细胞密度为5×108L－1，接种至96孔板培养16 h后，正常大鼠肝细胞分为正常对照组、正常 +TFLC 1，10 和 100 mg·L－1组;AFL 大鼠肝细胞分为 AFL模型对照组、AFL+TFLC 1，10和100 mg·L－1及 AFL+GSH 10 mmol·L－1对照组，各设3个复孔，培养42 h，于每孔加入MTT溶液(5 g·L－1)20 μl，37℃继续培养 4 h 后终止培养，吸弃上清，加 DMSO 150 μl，振荡10 min，使甲臜颗粒充分溶解。空白DMSO孔调零，酶联免疫检测仪570 nm波长处测定每孔吸光度(A)值，求其平均值。

1.5 肝细胞ALT和AST活性测定

AFL细胞分为AFL模型组、AFL+TFLC 1，10和100 mg·L－1及 AFL+GSH 10 mmol·L－1组，正常大鼠肝细胞为正常对照组，于6孔培养板培养48 h，收集细胞培养液，参照试剂盒方法测定ALT和AST活性。

1.6 肝细胞内TG含量测定

细胞分组同1.5。药物作用48 h的细胞，弃上清，PBS细胞洗3遍，加入胰酶消化，收集细胞悬液，反复冻融裂解细胞，超声细胞粉碎机裂解细胞2 min，离心取上清，按试剂盒说明书方法检测上清中TG含量。

1.7 逆转录PCR法测定肝细胞ADRP和PPARγ mRNA表达

细胞分组同1.5。肝细胞与药物作用48 h，Trizol一步法提取肝总RNA。按试剂盒说明书逆转录，ADRP引物序列，正义:5'-CTTGTGTCCTCCGCTTATGTCAGT-3';反 义:5'-CTGCTCCTTTGGTCTTATCCACCA-3'，349 bp。PPARγ 引物序列，正义:5'-ATTCTGGCCCACCAACTTCGG-3';反义:5'-TGGAAGCCTGATGCTTTATCCCCA-3'，339 bp。β 肌动蛋白引物序列，正义:5'-CAGTAACAGTCCGCCTAGAA-3';反义:5'-GATTACTGCTCTGGCTCCTA-3'，175 bp。引物由上海生物工程技术公司合成。ADRP和PPARγ反应条件分别为:57℃复性，37个循环和56℃复性，35个循环。琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察并扫描。凝胶成像系统对拍摄的照片进行密度扫描，以目的基因条带积分吸光度值对β肌动蛋白积分吸光度值的比值表示目的基因mRNA相对表达水平。

1.8 免疫组化方法测定肝细胞ADRP和PPARγ蛋白表达

细胞分组同1.5。肝细胞与药物作用48 h，4%多聚甲醛固定，3%H2O2灭活内源性过氧化物酶，PBS洗3次，(PPARγ需0.1%Triton X-100冰上破膜)，PBS洗3次，血清封闭，一抗(兔抗鼠ADRP多抗1∶300，鼠抗 PPARγ 单抗1∶500)4℃过夜，PBS洗3次，二抗(HRP标记山羊抗兔IgG和羊抗小鼠IgG抗体1∶800)37℃湿盒1 h(避光)，DAB显色，苏木素复染，脱水，封片。随机选取5个视野，以胞膜和(或)胞质出现明显的棕黄色和(或)黄棕色颗粒的细胞为阳性细胞，计数阳性细胞百分数。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠肝细胞的鉴定

常规锥虫蓝拒染法鉴定细胞活率在80%以上。光镜下，正常肝细胞为圆形(图1A)，细胞核位于细胞正中，可见到双核的肝细胞。免疫细胞化学染色显示，CK18阳性着色部位在胞核和胞浆，呈棕黄色颗粒(图1B)。

Fig.1 Identification of primary cultured rat hepatocytes.A:hepatocytes cultured for 4 h(×100)，Trypan blue staining;B:hepatocytes immunochemistry stained with cytokeratin 18(CK18)antibody.

2.2 TFLC对正常和AFL大鼠肝细胞存活的影响

表1结果显示，TFLC作用48 h对正常大鼠肝细胞存活无明显影响。与正常大鼠肝细胞比较，AFL模型大鼠肝细胞存活减少(P＜0.05);与AFL模型大鼠肝细胞比较，TFLC 100 mg·L－1作用48 h能显著增加AFL大鼠肝细胞存活(P＜0.05)，与GSH 10 mmol·L－1作用相当。

Tab.1 Effect of total flavone of L.coreana(TFLC)on proliferation of hepatocytes in normal and alcoholic fatty liver(AFL)model rats

2.3 TFLC对AFL大鼠肝细胞培养液中ALT和AST活性的影响

如表2结果显示，与正常大鼠肝细胞相比，细胞培养48 h的AFL模型大鼠肝细胞培养液中ALT和AST活性均明显升高(P＜0.05);TFLC 10 和100 mg·L－1作用48 h可降低AFL大鼠肝细胞培养液中ALT和AST活性(P＜0.05)，与GSH 10 mmol·L－1作用相当。

Tab.2 Effect of TFLC on activities of alanine aminotransferase(ALT)and aspartate aminotransferase(AST)in hepatocytes of AFL model rats

2.4 TFLC对AFL大鼠肝细胞内TG含量的影响

由表3看出，与正常大鼠肝细胞比较，培养48 h的AFL模型大鼠肝细胞内TG含量明显增加(P＜0.05);TFLC 10 和100 mg·L－1作用48 h 可减少AFL大鼠肝细胞内TG含量(P＜0.05)，与GSH 10 mmol·L－1作用相当。

Tab.3 Effect of TFLC on content of triglycerides(TG)in hepatocytes of AFL model rats

2.5 TFLC对AFL大鼠肝细胞ADRP mRNA和蛋白表达的影响

与正常肝细胞相比，AFL大鼠肝细胞ADRP mRNA表达明显增多(数据略)。如图2所示，与AFL模型大鼠肝细胞相比，TFLC 10 mg·L－1作用48 h能明显降低 ADRP mRNA表达(P＜0.05)，与GSH 10 mmol·L－1作用相当。

Fig.2 Effect of TFLC on adipose differentiation-related protein(ADRP)mRNA expression in hepatocytes of AFL model rats.See Tab.1 for cell treatment.A:representative RT-PCR for ADRP expression.B:RT-PCR quantitative analysis result of A.IA:integrated absorbance.Lane 1:AFL model;lane 2:AFL+TFLC 10 mg·L －1;lane 3:AFL+glutathione 10 mmol·L －1.±s，n=3.*P＜0.05，compared with AFL model group.

由图3和图4看出，正常大鼠的肝细胞有少量ADRP阳性表达(图3A)，AFL模型组ADRP阳性表达肝细胞明显增多(P＜0.01)(图3B)，AFL+TFLC 100 mg·L－1组(图 3E)和 AFL+ 谷胱甘肽10 mmol·L－1组(图3F)ADRP阳性表达细胞明显减少(P＜0.01)。

Fig.3 Effect of TFLC on ADRP expression in hepatocytes of AFL model rats(SP).See Tab.1 for cell treatment.A:normal;B:AFL model;C － E:AFL+TFLC 1，10 and 100 mg·L －1;F:AFL+glutathione 10 mmol·L －1.Arrows show ADRP positive cells.

Fig.4 Effect of TFLC on ADRP protein expression in hepatocytes of AFL model rats .See Tab.1 for cell treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal group;##P＜0.01，compared with AFL model group.

2.6 TFLC对AFL大鼠肝细胞PPARγ mRNA和蛋白表达的影响

如图5所示，与正常肝细胞相比，AFL大鼠肝细胞PPARγ mRNA表达明显增多(数据略)。与AFL模型大鼠肝细胞相比，TFLC作用48 h能明显降低AFL大鼠肝细胞PPARγ mRNA表达(P＜0.01)。

Fig.5 Effect of TFLC on peroxisome proliferator-activated receptorγ(PPARγ)mRNA expression in hepatocytes of AFL model rats.See Tab.1 for cell treatment.The intensity of PPARγ mRNA bands was normalized to that of β-actin.B was the semiquantitative result of A.Lane 1:AFL model;lane 2:AFL+TFLC 10 mg·L －1;lane 3:AFL+glutathione 10 mmol·L －1.±s，n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with AFL model group.

如图6和图7所示，正常组肝细胞可见少数PPARγ阳性表达细胞，着色较淡(图6A);模型组可见较多阳性表达细胞，胞核着色较深(图6B)。与 AFL 模型组相比，AFL+TFLC 100 mg·L－1组(图 6E)和 AFL+ 谷胱甘肽 10 mmol·L－1组(图6F)PPARγ阳性表达肝细胞明显减少(P＜0.05)，

表达程度降低。

Fig.7 Effect of TFLC on PPARγ protein expression in hepatocytes of AFL model rats.See Tab.1 for cell treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal group;#P＜0.05，compared with AFL model group.

3 讨论

AFL是酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)的早期阶段，发展为肝纤维化和肝硬化的危险性比单纯性脂肪肝高。本研究以18%的蔗糖为溶媒，以浓度递增的方式加入乙醇，让大鼠逐渐适应，建立AFL大鼠模型。慢性乙醇摄入可导致实验动物血脂水平增加，肝脂肪沉积[6]。

肝细胞具有丰富的酶系及多种特异性功能，体外培养用于药理学研究具有许多优点，在一定时间内离体培养细胞具有体内肝功能[7]。胶原酶二步灌流法[8]是目前原代肝细胞分离的常用方法，本研究经适当改进后成功分离大鼠原代肝细胞。慢性乙醇摄入导致AFL大鼠肝细胞内脂肪沉积，TG有不同程度增加。肝细胞损伤，增殖反应下降，ALT和AST水平升高。

Fig.6 Effect of TFLC on PPARγ protein expression in hepatocytes of AFL model rats(SP).See Tab.1 for cell treatment.A:normal;B:AFL model;C－E:AFL+TFLC 1，10 and 100 mg·L－1;F:AFL+glutathione 10 mmol·L－1.↑:PPARγ positive cells.

ADRP，又名亲脂素(adipophilin)，相对分子质量为48 ku，是脂肪细胞早期分化及脂质积聚的标志。ADRP具有调节脂质代谢的作用，可作为载体协助脂肪酸进入细胞，浓度和时间依赖性地促进长链脂肪酸的摄取。ADRP高表达可促进细胞胞浆内游离脂肪酸增多，增加肝TG的沉积，可使细胞内的脂滴数目增多，体积增大。抑制ADRP的表达能增加脂肪酸的β氧化。ADRP反义寡核苷酸可减少肝的TG和甘油二酯水平，增强胰岛素的作用[9]。免疫组化方法比油红O染色技术对实验者要求更少，同时ADRP免疫组化方法比HE染色或油红O染色更易发现微小脂滴，ADRP阳性表达可作为AFL形成的标志[10]。

PPARγ是主要表达于脂肪、肝和骨骼肌等组织的核转录因子，其目标基因直接参与脂肪细胞的分化成熟，并影响体内脂肪的合成及蓄积。PPARγ可刺激前脂肪细胞分化为脂肪细胞，诱导肝细胞脂肪酸重新合成引起脂质蓄积[11]，增加肝细胞的脂肪合成，并参与葡萄糖稳态的调节[12]。ADRP作为PPARγ的目标基因，表达增高可促进PPARγ的表达和肝脂肪变性[13]。

本研究采用两步灌流法获取大鼠原代肝细胞，MTT方法检测肝细胞活性。TFLC对正常肝细胞增殖反应无明显影响，但能增强AFL模型大鼠肝细胞增殖反应，抑制AFL大鼠肝细胞ALT和AST活性，降低AFL大鼠肝细胞内TG的含量。本研究结果发现，AFL大鼠肝细胞ADRP和PPARγ阳性表达细胞数增多，程度加重，TFLC干预后肝细胞ADRP和PPARγ阳性表达的细胞数和表达量均明显减少。TFLC可减少肝细胞内TG的沉积，对AFL大鼠肝细胞脂肪变性有抑制作用，可能与其改善肝细胞活性、调控肝细胞ADRP和PPARγ的表达、降低肝细胞TG的积聚有关。

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