督脉电针对大鼠急性脊髓损伤6h后Nestin表达的实验研究

北京中医药大学（100029）宋萌 王远征 时素华 李志刚

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是指由于外界直接或间接因素导致脊髓在损害的相应节段出现各种运动、感觉和括约肌功能障碍。近年来，SCI的治疗取得了长足的进步，且电针治疗SCI已得到医学界广泛的认可，但其具体作用机制尚不完全清楚。督脉电针是电针中最常用的一种，治瘫首取督脉[1]。本研究通过观察急性SCI后Nestin的表达，探讨针刺治疗急性SCI的作用机制，以期为临床针灸治疗急性脊髓损伤后提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 雄性SD大鼠32只，体重240±20g，由北京维通利华动物中心提供。随机分为空白组、模型组、电针组和药物组，每组8只。

1.2 针具 针灸针用华佗牌无菌针灸针，规格：0.30×13mm。电针用韩氏（HANS）电针仪，型号LH-202H。

1.3 模型制作 用10%的水合氯醛3.5mL/kg行大鼠腹腔麻醉，固定于弓形手术台上。按大鼠背部最下端肋骨缘横对T13为标志，向上依次定位T9～T11。背部脱毛后分离肌肉；用刀片自棘突向两侧剥离椎旁软组织，暴露T9～T11段棘突和椎板；弯眼科剪剪除T10椎板及其上关节突和下关节突，暴露脊髓；参照经典Allen’s打击法，打击T10段脊髓5cm×10g。模型成功的标准：鼠尾持续剧烈摆动数秒，双下肢及背部肌肉收缩，硬脊膜下出血，大鼠麻醉醒后双下肢不完全瘫痪。

1.4 治疗 电针组于造模后即大鼠苏醒后先CBS评分，再选取“大椎”、“命门”进行针刺治疗，进针约0.5～0.7cm。使用韩氏LH-202H电针仪，大椎接阴极，命门接阳极，持续脉冲电流，2Hz，治疗20min。药物组于造模后以30mg/kg体重的甲基强的松龙尾静脉注射。空白组和病理组不做任何治疗，但要在同一时间均抓取一次。

1.5 取材 造模后6h大鼠麻醉，行心脏灌注术：开胸暴露心脏，行左心室、主动脉插管，剪开右心耳，灌注生理盐水200mL，灌注8%多聚甲醛的磷酸缓冲液300mL固定至动物肢体僵硬后，以撞击点为中心，取出损伤部位（节段T9～T11）及其近、远端各2个节段，约1cm长脊髓浸入固定液。

1.6 检测 将组织经固定液固定、冲洗、梯度脱水、浸蜡、制石蜡切片（厚度6µm）进行Nestin表达检测：下行脱水，双蒸水洗涤；加入0.3%的过氧化氢甲醇溶液30min，双蒸水清洗5min×2 ；枸橼酸钠缓冲液PBS洗10min×3；加入羊血清1～2滴，37℃温箱存放30min；吸干羊血清，加入稀释的一抗，保湿盒中4℃，36h；将保湿盒移入温箱（37℃）1h，PBS洗5min×3；加入二抗，室温孵育2h，PBS洗10min×3；加入三抗，室温孵育2h，PBS洗10min×3；DAB显色：加入显色液，不超过30min，待细胞着色而背底颜色较淡时吸去显色液，PBS洗10min×3；梯度酒精脱水之后，中性树胶封片。

1.7 统计分析 统计分析采用软件进行。所得数据以均值±标准差（±s）表示。组间比较采用方差分析。以P＜0.05作为统计学差异显著性的标准，P＜0.01为差异极显著标准。

2 结果

Nestin在细胞胞浆中表达为棕褐色颗粒，主要集中于脊髓中央管室管膜、脊髓背侧出血坏死区。空白组仅见少量巢蛋白阳性细胞（见附图1）；模型组、电针组与药物组在脊髓损伤后6h巢蛋白阳性细胞数增加（见附图2、3、4和附表）。

3 讨论

中医学认为脊髓损伤后所产生的各种症状，乃因瘀阻督脉，枢机统帅失职，三阳经气血逆乱而致。其病因为“瘀血”，病机为“督脉枢机不利”。因此，在治疗上应以疏通督脉以壮一身之阳气，使气血调达、气机调畅。而督脉电针能够疏通督脉，温肾壮阳，活血化瘀，使阳气通达全身，使精血养四肢而恢复机体的各项功能。实验中也证实督脉电针可以起到对脊髓神经的保护作用和促进脊髓神经的再生作用[2]。

附表 阳性细胞表达阳性区域面积（±s，μm2）

附表 阳性细胞表达阳性区域面积（±s，μm2）

注：与空白组比*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

动物分组 数量（n） SCI后6h Nestin的表达空白组 8 31.280±20.678模型组 7 248.815±83.982**药物组 7 596.030±153.854**▲▲电针组 8 605.322±167.541**▲▲

附图2 6h模型组（50μm）

附图3 6h电针组（50μm）

附图4 6h药物组（50μm）

本实验观察到电针能促进急性脊髓损伤后Nestin大量表达。而Nestin是神经干细胞的标记蛋白[3]，往往与细胞的分化状态有关，这就表明电针对神经干细胞有很强的增殖作用。本次实验发现，与模型组比较，6h电针组和药物组的伤段脊髓组织Nestin含量都升高，有显著性差异（P＜0.05），电针组和药物组之间Nestin含量无统计学差异。模型组Nestin阳性细胞少，这可能是神经干细胞在SCI病理情况下的反应性增殖，以弥补神经系统组织学缺失。因此，成年哺乳动物体内存在的神经干细胞可能参与损伤过程的神经元再生和组织修复。

本实验Nestin的数据结果提示电针对大鼠SCI后神经功能有保护作用，电针提高了Nestin含量即促进了神经干细胞增多来起到促进SCI再生修复和功能恢复的作用。其参与机制可能有以下几点：①电针促进神经细胞的代偿性修复，减轻神经功能缺损以及病理损害程度；②电针治疗早期SCI，即急性期SCI，可显著改善损伤局部的血流量，提高神经营养因子的表达[4]，促进神经干细胞增殖[5]，清除氧自由基。这提示电针既能激发内源性神经干细胞的增殖，使其与神经系统生长发育有关的巢蛋白的表达保持在较高水平，又能改善损伤局部微环境，促进神经营养因子的分泌；③督脉电针可能通过促进受损伤脊髓组织细胞的代谢过程，引起细胞膜的腺苷酸环化酶活性升高，使ATP生成cAMP增加，从而激活了神经元和神经胶质细胞内蛋白激酶A的级联反应，启动细胞生长因子和神经营养因子等蛋白质的合成和分泌过程，从而促进脊髓内移植的神经干细胞存活和分化，以及促进受损伤神经元的存活及其轴突再生，重建神经通路，恢复脊髓的功能[6]。

SCI损伤后的再生修复是一个非常复杂的过程，电针在诱异脊髓损伤后神经干细胞增殖和分化上显示出巨大的潜力，标记神经干细胞增殖和分化的Nestin也不容忽视。随着对神经干细胞作用研究的不断深入，督脉电针对急性脊髓损伤后的治疗方面必将显示出更为广阔的前景。