2型糖尿病小鼠（KKAy）动物模型的早期肾脏病理改变

2013-11-10北京市怀柔区第一医院101400王伟

首都食品与医药 2013年2期

北京市怀柔区第一医院（101400）王伟

随着人口的老龄化和我国民众饮食结构的改变，我国糖尿病（diabetes mellitus，DM）的发病率也呈持续上升趋势。由于2型糖尿病发病率远高于1型，患者年龄偏大，多合并高血压及心脑血管性疾患，故对人类的危害更大。糖尿病肾病（diabeticnephropathy，DN）是DM最常见和最严重的并发症之一。DN病理表现为肾小球硬化，发病早期表现为肾小球滤过率降低和正常白蛋白尿，继而由于基底膜增厚导致微量白蛋白尿，后期出现持续的蛋白尿、水肿、高血压等肾病表现。KKAy小鼠是自发2型糖尿病的动物模型[1]。其发病是在遗传易感的基础上加环境因素而诱发与人类2型糖尿病表现极为相似。本研究引进该动物模型，观察其作为2型糖尿病致肾脏病模型的价值，探讨其发病机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 6～8周雄性KKAy小鼠8只和KK小鼠11只，采用普通饲料喂养。

1.2 实验方法和取材随机血糖大于13.9mmol/L者诊断为糖尿病。实验结束时取血测血糖等指标后，以3%戊巴比妥钠腹腔麻醉，迅速分离肾脏，留标本于4%中性甲醛，右肾置于液氮。

1.3 肾脏组织PAS染色部分肾脏组织于4%中性甲醛中固定24h以上，常规脱水、透明、浸蜡和包埋，切片3µm厚，经PAS染色。

1.4 肾脏组织免疫组化染色常规二甲苯、乙醇脱蜡至水，3% H202甲醇封闭内源性过氧化物酶，孵育20min后，以1∶100 VEGF抗体（一抗，北京中杉公司）4℃过夜孵育，阴性对照只加PBS液，辣根酶标记链亲和素（二抗，北京中杉公司）室温孵育60min后，以DAB法显色。结果以IPP5.1图像分析系统进行半定量分析，比较肾小球平均光密度（肾小球着色面积IOD/肾小球总面积）。

1.5 实时荧光定量PCR检测肾皮质VEGF基因表达用Trizol试剂（Invitrogen，美国）一步法提取大鼠肾脏总RNA，电泳判定RNA的质量。使用ReverTra Ace-α cDNA试剂盒（TOYOBO，日本）合成大鼠肾脏cDNA。体系20µL，5×RT buffer 4µL，dNTPs 2µL，Random Primer 1µL，ReverTra Ace 1µL，RNase inhibitor 1µL，RNA 3µL，RNase free H2O 8µL。反应条件：30℃ 10min，42℃ 20min，99℃5min，4℃ 5min。合成的cDNA于-80℃冻存。用ABI®PRISM 7300（美国 ABI Biosystem）实时荧光定量PCR仪进行基因检测。SYBR® Green PCR Master Mix购自TOYOBO（日本）。体系50µL，SYBR®Green Real time PCR Master Mix 25µL，蒸馏水18µL，上游引物1µL，下游引物1µL，cDNA 5µL。反应条件：95℃ 60s，1循环；95℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 45s，40循环。内参照为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。引物均由上海生工生物公司合成。VEGF上游引物序列5’-TTACTGCTGTACCTCCAC-3’，下游引物序列5’- ACAGGACGGCTTGAAGATA-3’[2]；GAPDH上游引物序列5’-CATGCCAA CGCCCTCTTCGA-3’，下游引物序列5’-TGTCCCCGTTCTCATCCTGCAC-3’。使用2-ΔΔCT方法计算基因表达情况。

1.6 统计学分析用SPSS10.0统计分析软件处理实验数据，所得数据符合正态分布的以（±s）表示，偏态分布的变量数据以中位数（范围）表示，并经对数转换使之正态化后采用t检验及方差分析进行统计分析。

2 结果

2.1 两组肾皮质病理改变比较实验结束时KA组小鼠的血糖（19.75士3.98）mmol/L明显高于KB组（8.14士3.15）mmol/L（P＜0.01）。PAS染色后光镜下可见KA组有肾小球硬化表现，即ECM明显增多，肾小球系膜区增宽、HE染色阳性物质增多，基底膜增厚，见附图1。

2.2 肾小球VEGF的免疫组化比较 KA组小鼠肾小球系膜区、脏层上皮细胞、壁层上皮细胞、内皮细胞等多处肾小血管壁均出现了VEGF阳性着色，KB组个别也有VEGF阳性着色，但明显轻于前者。图像分析显示KA组和KB组肾小球VEGF平均光密度分别为0.03和0.01（P＜0.01），见附图2。

2.3 肾脏组织VEGF的real-time PCR比较KA组糖尿病小鼠肾脏VEGF mRNA表达明显高于KB对照组17%（P＜0.01）。

3 讨论

糖尿病肾病的主要病理变化是肾小球基底膜（GBM）和以肾小球系膜区为主的细胞外基质（ECM）积累，导致弥漫性或结节性肾小球硬化。从本实验的病理检查可见，KA组小鼠肾小球体积增大，PAS红染区明显扩大，肾小球毛细血管袢略显僵硬，系膜基质增生，提示已经出现早期肾脏形态学改变，尤其是肾脏微血管损伤。糖尿病肾病的发病机制目前尚未完全阐明，研究认为有多方面因素参与，国内余叶蓉等研究显示[3]，在胰岛素抵抗状态下，大血管内皮依赖性血管舒张功能是受损的。VEGF是目前所知作用最强的一种促血管生成因子，具有高度特异性地促血管内皮细胞生长的作用[4]。高血糖、组织低氧、氧化应激及多种细胞因子可刺激组织细胞产生VEGF。VEGF过度表达可通过改变内皮细胞的结构和功能，破坏血管内皮细胞的紧密连接，促进血管内皮细胞增殖等作用，从而改变细胞外基质分泌，增加毛细血管通透性，促进新生血管形成。它可以通过增加肾脏微血管的通透性和单核细胞的渗出参与肾损害的发生。有研究表明，糖尿病大鼠肾脏肌酐清除率、蛋白尿增加，可能与肾组织VEGF表达增加相关[5][6]。通过免疫组化和实时定量PCR方法也证实了KKay小鼠VEGF在肾脏的表达明显增加。肾小球增高的VEGF在糖尿病肾病的发生、发展中作用复杂，不排除高血糖、糖基化终末产物、氧自由基等物质对毛细血管内皮细胞造成一定损害，内皮细胞分泌一些细胞分子，其中包括VEGF，加重内皮细胞的损伤，造成血管通透性增强，蛋白漏出，形成蛋白尿，漏出的蛋白又刺激细胞外基质增生加重肾小球硬化，参与糖尿病肾病的发生发展。