脑梗死患者血浆硫化氢、胱硫醚－β－合酶含量变化及意义

郑永强 叶 飞 刘南暖 邓晓玲 徐 悦 周发明

脑梗死是由于供应脑组织的动脉发生病变所导致的疾病，常伴偏瘫、失语、偏盲、意识障碍甚至死亡。内源性H2S是机体内重要的气体信号分子，主要是由胱硫醚－β－合酶、胱硫醚－γ－裂解酶和半胱氨酰转移酶催化L－半胱氨酸生成，其中CBS是中枢神经系统产生H2S的酶［1］。本研究旨在探讨脑梗死患者与健康对照组中H2S、CBS水平的差异，脑梗死不同梗死面积及相关危险因素对内源性H2S、CBS分泌的影响，以探讨内源性H2S、CBS在脑梗死发病中可能的病理生理机制。

1．材料与方法

1.1 材料 选择在我院2012年6月～12月神经内科住院的脑梗死患者167例，男性85例，女性82例，平均年龄60.1±9.3岁。所有患者均经头颅CT和(或)MRI检查确诊，符合1995年全国第四届脑血管病会议制定的诊断标准。所有脑梗死患者中，合并高血压55例，糖尿病28例。脑梗死组再根据梗死体积按Pu llicino公式［2］计算分为:大面积梗死(梗死灶＞10cm3)29例，中面积梗死(5～10cm3)43例，小面积梗死(＜5cm3)95例(其中87例腔隙性脑梗死患者)。排除标准:患者入院前曾服用影响硫化氢和胱硫醚－β－合酶代谢的药物，如抗癫痫药、镇静催眠药、抗胆碱药、服用维生素B1、B6、B12、叶酸及接受干扰素治疗者;心源性脑栓塞、肺肝肾功能异常、癫痫、甲状腺疾病、银屑病、肿瘤、恶性贫血、内分泌功能失调等重大疾病者。

对照组为108例同期我院门诊健康体检者，男性54例，女性54例，平均年龄60.1±9.1岁，既往无心脑血管疾病和糖尿病病史，无甲状腺、肝肾功能明显减退及代谢性疾患，性别、年龄构成与脑梗死组无统计学差异。本研究经我院伦理委员会批准，所有研究对象均获知情同意。

1.2 方法

1.2.1 试剂及仪器:全自动酶标仪BIO-TEK ELX800(美国宝特公司)，低温高速离心机;CBS检测试剂盒和考马斯亮兰蛋白检测试剂盒由武汉博士德公司提供。

1.2.2 标本采集:所有患者于入院后第二天清晨空腹用真空采血管采血5ml(肝素抗凝)，以3000r/min离心10分钟，分离血清，置于 －70℃冰箱保存，用于测定血浆 H2S、CBS含量。

1.2.3 血浆H2S水平的测定:采用分光光度法测定血浆H2S［3］。在试管中加入1%醋酸锌0.25ml然后加入0.1ml血浆，使血浆中的硫离子与醋酸锌充分结合形成醋酸锌胶体，再加入20mmol/L对苯二胺盐酸盐、7.2mmol/L盐酸250μl和30mmol/L三氯化铁、1.2mmol/L盐酸250μl室温孵育20分钟，使之充分显色，加入10%三氯醋酸0.5ml使蛋白沉淀，离心(6000r/min)5分钟，吸取上清液，用全自动酶标仪在波长665nm处检测吸光度。根据NaHS标准曲线计算血浆中硫化氢的含量，结果以μmol/L为单位。

1.2.4 血浆CBS水平的测定:检测前做标准曲线，使样品符合试剂盒的检测范围，加样板分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，将样品加于酶标板孔底部，37℃反应120分钟，依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色，依次加入反应液及终止液，加入终止液后立即检测450nm波长处各孔的光密度(OD值)，应用考马斯亮兰蛋白检测试剂盒检测样品蛋白含量，依据公式计算CBS活性，以上操作严格按照说明书操作。

1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件，指标检测结果用(±s)表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2．1 脑梗死患者血浆H2S、CBS含量均明显低于健康对照组(P ＜0.01，见表1)。

表1 脑血管病各组患者与健康对照组血浆H2S、CBS 比较(±s)

表1 脑血管病各组患者与健康对照组血浆H2S、CBS 比较(±s)

注:*表示P＜0.01与对照组比较。

组别 例数年龄 H2S CBS对照组 108 60.1±9.1 50.1±3.4 39.0±3.0 CI 167 60.1±9.3 25.8±9.2* 4.1±3.8*

2．2 在167例脑梗死患者中，大面积脑梗死患者H2S含量明显高于中面积和腔隙性脑梗死患者(P＜0.01)，CBS含量显著低于腔隙性脑梗死患者(P＜0.01)，而与中面积脑梗死患者无显著性差异(P＞0.05)，无统计学意义。

表2 脑梗死患者血浆H2S、CBS比较(±s)

表2 脑梗死患者血浆H2S、CBS比较(±s)

注:*表示P＜0.01，与中面积和腔隙性脑梗死患者比较。

组别年龄 例数 H2S CBS大面积 60.7±8.3 29 38.2±9.5* 1.8±0.1*中面积 61.5±8.2 43 18.8±2.8 2.2±0.3小面积59.3±8.3 95 25.2±5.9 5.7±1.5

3.讨论

脑梗死主要是由于大脑血液供应不足引起的一种常见的急性或慢性脑血管疾病，缺血引起的神经细胞不可逆的损伤，从而导致脑功能的降低或损坏。如果能在疾病进展早期对神经元进行保护，从蛋白分子基础上调控缺血的病理生理过程，尽快阻止或消除有害的因素，将可以最大限度争取为脑缺血的救助争取时间，延缓或减轻不可逆神经系统损伤的进展。脑缺血后，机体也会作出反应，主动地产生神经保护作用的相关因子，这种机体内在的对抗机制使机体能耐受一定程度的缺血损伤。如事先短暂的缺血或预适应可动员机体内在的防护能力，从而对随后的严重缺血产生保护作用［4］。本研究主要是通过研究脑梗死患者的内源性硫化氢所起的可能作用及其机制，为预防和治疗脑梗死患者提供新的药物研究方向。

内源性硫化氢是由同型半胱氨酸代谢产物之一的半胱氨酸在胱硫醚β－合酶、胱硫醚－γ－裂解酶或半胱氨酸转移酶的催化下产生的。脑内产生硫化氢的主要酶是胱硫醚β－合酶。已有众多研究表明硫化氢和高同型半胱氨酸之间可能存在内源性的相互调节作用。

在脑梗死患者中硫化氢和胱硫醚－β－合酶减少可能与在脑缺血再灌注过程中一氧化氮大量生成，一氧化氮可结合到胱硫醚－β－合酶的亚铁血红素部分时，会抑制酶的活性，从而使硫化氢和胱硫醚－β－合酶生成减少。有研究证实:揭示在脑组织缺氧缺血状态下，出现内源性胱硫醚－β－合酶/硫化氢体系活化，以及胱硫醚－β－合酶/硫化氢体系通过上调bcl-2表达，拮抗缺氧缺血所致脑组织损伤，减少细胞凋亡的作用机制［5］。而大面积脑梗死患者中，胱硫醚－β－合酶减少考虑与脑组织大量坏死，包括神经元和神经胶质细胞破坏，从而导致脑组织硫化氢的生成减少，而实际上我们检测的硫化氢生成增多，考虑可能与机体应激导致，外周硫化氢生成明显升高有关。目前有研究表明，在危重病患者中，随血清硫化氢浓度水平增高，危重病患者病死率也随之增高［6］。颅脑外伤大鼠急性期血清硫化氢血清内源性硫化氢的含量随损伤程度加重而浓度升高［7］。可能与硫化氢具有抗氧化应激的作用，能升高细胞内谷胱甘肽水平，以一种剂量依赖型的方式保护神经细胞免受谷氨酸的氧化毒性作用，是一种内源性过氧化亚硝酸盐清道夫，发挥着抗自由基的作用，但过高的硫化氢导致机体中毒而危及生命，在大面积脑梗死病例中有14例死亡，硫化氢浓度均偏高，但其机制有待进一步的研究。

综上所述，血浆中硫化氢、胱硫醚－β－合酶含量的变化可能参与脑梗死的发病机制，因此选择作用于H2S、CBS靶点生成的药物，为临床药物研制提供一个新的方向。

1 PongWW，S touracova R，Frank N，et a.l C om parat ive local ization of cystath ion in e beta-synthase and cystath ion ine gamm a-lyase in retina differences between amphibians and mammals［J］．J Comp Neuro，2007，505(2):158－165.

2 Pu llicino P，N elson RF，Kenall BE，et al.Sm all deep in farcts diagnosed on com puted tom ography［J］．Neurology，1980，30(3):1090－1091．

3 任彩丽，赵红岗，蔡德亮，等.脑梗死患者血浆中内源性硫化氢含量的变化［J］．中国神经精神疾病杂志，2010，36(1):43－44.

4 Liu XQ，Sheng R，Qin ZH.The neuronprotective mechanism of brain ischemic preconditioning［J］．Acta Pharmacol Sin，2009，30(8):1071－1080.

5 孟蕾，赵惠君，刘冬焱，等.胱硫醚p合成酶/硫化氢体系在缺氧缺血性脑损伤中表达及锌原卟啉对其的影响［J］．临床儿科杂志，2011，29(11):1076 －1080．

6 田国祥，姚英，孟庆义．血清硫化氢浓度与APACHEⅢ评分在危重病患者预后中的应用价值［J］．中国综合临床，2010，26(6):591－593．

7 边艳峰，杨晓明，冯杰，等.颅脑外伤大鼠急性期血清硫化氢浓度的变化及其意义［J］．中国药物与临床，2010，10(10):1112 －1113．