骨桥蛋白在胆固醇结石患者胆囊黏膜上皮中的表达及意义

朱 斌,袁岱岳,邵伟斌,严栋梁,郝清亚

(江苏省南通市第一人民医院肝胆外科,江苏南通,226001)

骨桥蛋白(OPN)是一种具有多种生物活性的酸性非胶原糖蛋白,最早从骨基质分离出来,具有钙离子结合的特性[1]。现已证明OPN在泌尿系结石的发生中起重要作用[2],但关于其与胆结石形成的关系的研究与报道较少。本研究采用免疫组织化学方法检测OPN在胆固醇结石患者和正常人的胆囊组织中的表达情况,探讨OPN在胆囊胆固醇结石形成中的作用,现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010年7月—2012年10月本院普外科胆囊病理标本共35例,并分为结石组和非结石组。结石组共纳入单纯胆囊胆固醇结石患者25例,男 6例 ,女 19例,年龄 24～83岁,平均(41±9.7)岁,术后以病理诊断及胆囊结石剖面结构相结合作为诊断依据。非结石组纳入因其他原因行胆囊切除的非胆囊结石患者的胆囊标本10例,男8例,女2例,年龄41～77岁,平均(52±8.6)岁,其中肝癌5例,胰腺癌 2例,肝外伤1例,胆囊挫裂伤1例,胃癌1例,病理诊断为正常或接近正常胆囊,表现为胆囊黏膜腺体无增生、萎缩、坏死脱落,没有纤维脂肪组织增生,有少量或无炎性细胞浸润。

1.2 试剂与实验方法

鼠抗人OPN单克隆抗体(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)工作浓度为1∶100。采用Elivision二步法进行染色。所用Elivison试剂盒(PV-9000)和DAB酶底物显色(均购自北京中杉金桥生物技术有限公司)。具体步骤:石蜡组织行4 μ m厚度连续切片,经常规脱蜡水化后,其余操作按Elivison试剂盒说明书进行。以阳性胆囊癌切片做阳性对照,PBS缓冲液代替一抗做阴性对照。

1.3 结果判断标准

对OPN阳性表达的评估采用半定量积分法,综合阳性细胞的百分比及染色强度进行判断。阳性细胞<5%为0分,6%～25%为1分,26%～50%为2分,51%～75%为3分,>75%为4分。染色强度无着色为0分,淡黄色为1分,黄色为2分,棕黄色为3分。取阳性细胞百分比和染色强度两项积分评分,0分为(-),1～4分为(+),5～8分为(2+),9～12分为(3+)。所有标本均由两位经验丰富的病理科医师以双盲法阅片。

1.4 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件对结石组和对照组的数据进行统计学分析,进行Mann-Whitney U检验,计算出P值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

在OPN表达阳性的细胞内,见OPN集中表达于胆囊黏膜上皮细胞的胞质及管腔侧,在脱落的胆囊黏膜上皮细胞中也有表达。OPN在结石组中多呈阳性或强阳性表达(图1A),非结石组胆囊黏膜中呈弱阳性或阴性表达(图2B)。经半定量分析,2组有显著差异(P<0.05),见表1。

图1 OPN在胆囊黏膜上皮细胞内的表达情况

表1 OPN在2组中的表达

3 讨 论

OPN是一种非胶原性酸性骨基质糖蛋白,其分子内部含有包括一RGD序列(精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸),该序列通过与其受体avβ3整合蛋白结合参与钙离子的代谢和组织的矿化,是促进细胞黏附的蛋白质中的特有结构[3-5]。OPN在消化系统的许多脏器都有表达,其中包括胆囊黏膜上皮及胆汁[1]。已证实OPN在泌尿系结石的形成和发展过程中有重要的作用,但是否有参与胆结石的形成,目前的研究报道较少。

本实验通过免疫组化Elivision二步法,检测OPN在单纯胆囊胆固醇结石患者与非结石患者胆囊黏膜上皮内的表达。与Ichikawa H等的报道相似[6],作者发现OPN集中表达于胆囊黏膜上皮细胞的胞质及管腔侧,在脱落的胆囊黏膜上皮细胞中也有表达,单纯胆囊胆固醇结石组患者OPN的表达要显著高于非结石组。现已证实在胆固醇结石中含有大量的钙盐沉积和OPN的表达[1,6]。有学者从胆固醇结石患者的胆汁中分离到OPN的功能区域—钙离子的结合位点RGD片段[6]。因此可以认为OPN从胆囊黏膜上皮分泌,最终被包裹在胆固醇结石的中心,提示OPN可能在胆固醇结石的形成过程中有着重要的作用。

OPN在小鼠、大鼠及人肾脏均有表达,主要位于亨利氏攀升枝和远曲小管,这些部位是与尿石形成有关矿物质的高浓缩区[7]。草酸钙晶体在肾小管上皮细胞腔面的黏附沉积对肾结石的形成起初始促进作用[3]。Lieske等报道,OPN可通过其RGD序列与草酸钙晶体结合,来影响草酸钙晶体与肾小管上皮细胞结合[8-9]。国内王莹[10]用乙二醇诱导建立SD大鼠肾结石模型,发现从诱导第10天起肾结石组大鼠的OPN在远曲小管的表达要显著高于对照组。此结果与本研究OPN在单纯胆囊胆固醇结石患者中表达结果相类似,因此作者设想OPN是否也通过类似影响泌尿系结石形成的机制影响胆结石的形成。

本研究提示OPN参与了胆固醇结石的形成,可能会为今后治疗胆囊结石的诊断和治疗提供一个新的靶点,但其具体的作用机制仍有待进一步研究解决。

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