负载pcDNA3.1-EGFP壳聚糖纳米颗粒的制备及其生物学特性分析

邵小青,陈 艳,陈 贝,陈泽烨,奚菊群,龚卫娟

(扬州大学医学院,1.免疫学教研室;2.药剂学教研室,江苏扬州,225001)

“纳米凝胶”(Nanogel)是能够在水溶液中分散并具有纳米尺寸的水凝胶颗粒,通常由物理或化学交联的聚合物网络结构所组成[1]。聚电解质纳米凝胶可结合带有相反电荷的小分子药物、核酸类药物及蛋白质,从而可用于制备新型纳米药物或基因疫苗。纳米药物还具有稳定性好、对胃肠刺激性小、毒副作用小、生物利用度高、具有靶向性和缓释功能等优点[2-4]米凝胶负载pcDNA3.1或其重组质粒后的生物学效应,本文制备并鉴定了壳聚糖纳米凝胶负载pcDNA3.1-EGFP重组质粒的相关生物学特性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

壳聚糖(脱乙酰度85%,Mv=200000)来自浙江玉环海洋生物有限公司,经本实验室自行修饰为羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖,N-[(2-hydroxy-3-trimethylammonium) propyl]。 CT-26、RAW264.7细胞株来自美国ATCC公司。pcDNA3.1-EGFP质粒为本实验室构建并保存[5]。体Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司,质粒大量抽提试剂盒来自Qiagen公司,细胞数目检测MTS/PMS试剂盒来自Promega公司,RPMI-1640培养基购自invitrogen公司,胎牛血清购自杭州四季青公司。

1.2 方法

1.2.1 负载质粒的壳聚糖纳米颗粒制备:利用Qiagen公司大量质粒提取试剂盒,测定质粒的浓度和总量,调整浓度为1 mg/mL,壳聚糖浓度调整为 1 mg/mL。按1∶0.5,1∶1,1∶2质量比,总体积共设为1 mL。将质粒溶液滴加入壳聚糖中,300 rpm,室温振荡30 min,混合均匀。4℃离心机最大速度离心 20～25 min,彻底分离游离DNA和纳米颗粒。

1.2.2 纳米颗粒包封率测定:利用紫外分光光度计检测上清中DNA浓度,并根据体积计算游离DNA量。纳米颗粒包封率的计算公式为(质量总量-游离 DNA量)/质量总量 ×100。另外,利用DNA琼脂糖电泳鉴定游离DNA的量。

1.2.3 纳米颗粒粒径及电位测定:利用激光动态光闪射仪检测纳米颗粒的粒径大小,利用Zeta电位仪检测样品中纳米颗粒的电荷状况,每个样品均扫描20次。

1.2.4 纳米颗粒转染细胞及荧光检测:分别取小鼠巨噬细胞系RAW264.7和肠癌细胞系CT-26,用无血清DMEM洗涤接种24孔培养板。次日纳米颗粒用DMEM稀释为20%的浓度,分别加到细胞培养体系。6、16 h后用荧光显微镜观察绿色荧光细胞。并且于6、16 h消化细胞,流式细胞仪分析绿色荧光细胞的比例。另外,用商品化脂质体包裹相同量的质粒作为阳性对照,单纯质粒溶液转染作为阴性对照。

1.2.5 纳米颗粒的细胞毒性分析:取对数期培养的RAW264.7和CT-26细胞,以每孔5000个细胞的数目加入96孔板内,每种纳米颗粒设4个复孔。于24、72 h后每孔内加入20 μ L MTS/PMS试剂,1 h后利用酶标仪检测490 nm处的吸光度值。

2 结 果

2.1 纳米颗粒对pcDNA3.1-EGFP质粒的包封率

不同壳聚糖与质粒的质量比对纳米颗粒的包封率产生直接影响。研究结果发现壳聚糖:质粒的质量比为1∶1时,纳米颗粒的包封率最高,达到99%。而两者质量比为1∶2时,纳米颗粒的包封率最低(图1)。取包封后液体的上清进行琼脂糖电泳,仅在壳聚糖与质粒质量比为1∶2的液体中看到游离的DNA(图2)。因此,当壳聚糖与质粒在液体中以合适比例混合、并适度振荡后,可以高效率地包裹DNA质粒。

图1 壳聚糖-pcDNA3.1-EGFP纳米颗粒的包封率分析

图2 壳聚糖包裹质粒体系上清的凝胶电泳结果

2.2 纳米颗粒的大小及Zeta电位测定

取制备好的纳米颗粒溶液,用激光动态光闪射仪检测颗粒直径,结果显示3种不同的壳聚糖纳米颗粒粒径均分布在100～300 nm。用Zeta电位仪检测纳米颗粒的电荷,结果显示三种颗粒均携带正电荷,范围分布在40～100 mV(表1)。

表1 壳聚糖纳米颗粒的粒径及Zeta电位分布

2.3 细胞摄取纳米颗粒的活性测定

将制备好的纳米颗粒用无血清培养基稀释后,转染RAW264.7和CT-26细胞,6、16 h分别用荧光显微镜观察荧光细胞。结果显示,当加入纳米颗粒6 h或16 h后,RAW264.7和CT-26细胞培养体系中均可观察到荧光细胞(图3,图5)。并且在相同时间点,将两种细胞消化、洗涤,采用流式细胞仪定量检测荧光细胞频率,结果显示16 h绿色荧光细胞的频率较6 h轻度升高(图4,图6)。

图3 壳聚糖纳米颗粒转染RAW264.7细胞的荧光图 (100倍)

图4 流式细胞仪检测壳聚糖纳米颗粒转染RAW264.7细胞后的表达效率

图5 壳聚糖纳米颗粒转染CT-26细胞的荧光图 (100倍)

图6 流式细胞仪检测壳聚糖纳米颗粒转染CT-26细胞后的表达效率

2.4 纳米颗粒的细胞毒性检测

为观察纳米颗粒体内运用时潜在的细胞毒性,将不同质量比制备的纳米颗粒悬液分别与RAW264.7和CT-26细胞共培养,于 24、72 h利用MTS/PMS法检测细胞培养孔内活细胞的数目,结果发现,与单独培养基或单纯质粒相比,纳米颗粒对RAW264.7、CT-26细胞的生长无明显影响(P>0.05),且不同方法制备的壳聚糖纳米颗粒之间无明显差异(P>0.05)。

3 讨 论

本研究首先利用壳聚糖材料,制备运载重组基因表达载体的纳米颗粒,初步检测了纳米颗粒的粒径和电位。其次,将纳米颗粒加入细胞培养体系,证实该负载荧光蛋白表达基因的纳米颗粒可被细胞摄取、并在细胞内得到表达。最后发现这些壳聚糖纳米颗粒对细胞的体外生长没有明显毒性。该研究结果说明本实验所用的壳聚糖纳米颗粒制备方法简单、易行,还提示基于pcDNA3.1质粒载体构建的纳米颗粒可被多种细胞摄取并表达,为利用纳米材料运载基因疫苗提供直接的实验依据。

肿瘤部位存在免疫细胞缺陷,其血管具有高渗透性,使得一定尺寸、大小和分子量的颗粒物具有非特异靶向性,这种非特异性的肿瘤富集现象称为EPR效应(enhanced permeablity retention effect,EPR)[6]。因此通过纳米颗粒运载特定药物或基因,可具备一定的肿瘤靶向性。另外,通过将一些传统药物加以改造制成纳米颗粒可以达到优化药物特性的目的。比如将核苷类抗癌、抗肿瘤药物连接到角鲨烯上,可以聚集成100～300 nm的纳米颗粒,这将提高药物的药效和稳定性,降低肿瘤的抗药性[7-8]。

利用天然阳离子多糖(壳聚糖)运载DNA,因其与带负电荷的核酸分子结合作用很强,体内使用具有很好的生物降解性、生物相容性,较低的细胞毒性,价格也很低廉[9-10]。另一方面,壳聚糖纳米颗粒运送DNA,可能存在胞浆内DNA释放迟缓、不能逃离细胞内体(溶酶体)酶的作用,被降解而不能表达出目的产物的现象[11-12]。高分子量壳聚糖在生理pH状态下容易聚集、黏稠度高而丢失在体内运送基因疫苗的可能性[13-14]。本研究中对壳聚糖进行羟丙基三甲基氯化铵修饰,使该材料在生理pH状态下仍然保持很好的水溶性。另外,尽管我们制备的壳聚糖纳米颗粒可被细胞摄取,但低于阳离子脂质体介导相同质量DNA转染后的表达效率,提示可进一步改善纳米颗粒制备条件,以获得更好的细胞摄取率[15]。

综上所述,本研究基于自行制备的羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖材料,成功制备负载pcDNA 3.1-EGFP表达载体的纳米颗粒。其大小在100～300 nm,携带正电荷,被细胞有效摄取而表达出绿色荧光蛋白,并具有很好的生物安全性。该实验结果对制备负载pcDNA3.1系列重组载体的纳米颗粒,体内运送基因疫苗而治疗肿瘤,提供了重要的参考依据。

[1]Asadian-Birjand M,Sousa-Herves A,Steinhilber D,et al.Functional nanogels for biomedical applications[J].Curr Med Chem,2012,19(29):5029.

[2]Yallapu M M,Jaggi M,Chauhan S C.Design and engineer-ing of nanogels for cancer treatment[J].Drug Discov Today,2011,16(9/10):457.

[3]Chiang W H,Huang W C,Chang C W,et al.Functionalized polymersomes with outlayered polyelectrolyte gels for potential tumor-targeted delivery of multimodal therapies and MRimaging[J].J Control Release,2013,168(3):280.

[4]Ghaemy M,Naseri M.Synthesis of chitosan networks:Swelling,drug release,and magnetically assisted BSA separation using Fe3O4 nanoparticles[J].Carbohydr Polym,2012,90(3):1265.

[5]范敏其,龚卫娟,龚春香,等.小鼠CD86基因启动子的构建及活性分析[J].现代免疫学杂志,2009,29(5):359.

[6]Miller T,Breyer S,van Colen G,et al.Premature drug release of polymeric micelles and its effects on tumor targeting[J].Int J Pharm,2013,445(1/2):117.

[7]Chacko RT,Ventura J,Zhuang J,et al.Polymer nanogels:a versatile nanoscopic drug delivery platform[J].Adv Drug Deliv Rev,2012,64(9):836.

[8]Thomann-Harwood L J,KaeuperP,Rossi N,et al.Nanogel vaccines targeting dendritic cells:contributions of the surface decoration and vaccine cargo on cell targeting and activation[J].J Control Release,2013,166(2):95.

[9]Nimesh S.Potential implications of nanoparticle characterization on in vitro and in vivo gene delivery[J].Ther Deliv,2012,3(11):1347.

[10]Cambridge C D,Singh S R,Waffo A B,et al.Formulation,characterization,and expression of a recombinant MOMP Chlamydia trachomatis DNA vaccine encapsulated in chitosan nanoparticles[J].Int J Nanomedicine,2013,8:1759.

[11]Li H,Labean T H,Leong K W.Nucleic acid-based nanoengineering:novel structures for biomedical applications[J].Interface Focus,2001,1(5):702.

[12]Huang K S,Wang C Y,Yang C H,et al.Synthesis and characterization ofoil-chitosan composite spheres[J].Molecules,2013,18(5):5749.

[13]Nuhn L,Hirsch M,Krieg B,et al.Cationic nanohydrogel particles as potential siRNA carriers for cellular delivery[J].ACS Nano,2012 Mar 27;6(3):2198.

[14]Wu W,Shen J,Banerjee P,et al.Chitosan-based responsive hybrid nanogels for integration of optical pH-sensing,tumor cell imaging and controlled drug delivery[J].Biomaterials,2010,31(32):8371.

[15]Schmitt F,Lagopoulos L,Kuper P,et al.Chitosan-based nanogels for selective delivery of photosensitizers to macrophages and improved retention in and therapy of articular joints[J].J Control Release,2010,144(2):242.