抗阻训练对衰老大鼠腓肠肌Bcl-2BaxmRNA及线粒体膜电位的影响

林文弢，王 震，翁锡全，徐国琴，黄丽英

细胞凋亡是多细胞有机体为保持自身组织稳定、调控细胞增殖与死亡之间的平衡，由基因调控的主动、程序性死亡过程[1]，是机体维持内环境稳定的必要机制。研究表明，按细胞凋亡功能来分类，调控的基因常分为诱导细胞凋亡的基因和抑制细胞凋亡2大类。在细胞凋亡过程中，Bcl-2家族成员起着相当重要的作用[2]。运动对细胞凋亡影响的研究也证明，力竭运动对骨骼肌细胞凋亡的影响较为明显[3]，而有关抗阻训练对骨骼肌细胞Bcl-2、Bax mRNA和线粒体膜电位（ΔΨmt）下降的细胞百分率的影响，以及Bcl-2/Bax mRNA比值的变化与线粒体膜电位（ΔΨmt）下降的细胞百分率有何关系等的研究较少。本文以自然衰老的雄性大鼠为实验对象，重点探讨衰老雄性大鼠8周抗阻训练后的腓肠肌Bcl-2、Bax mRNA表达水平和线粒体膜电位（ΔΨmt）下降的细胞百分率的变化。

1 材料与方法

1.1 实验对象与方法

实验对象为18月龄衰老的大鼠，该衰老大鼠为自然衰老。从广东生物医学动物实验中心购买11月龄雄性SD大鼠（SCXK（粤）2008-0002），大鼠体重为（779±50）g。按常规方法分笼饲养至18月龄，饲养过程控制温度和湿度，室温（23±2）℃，湿度40%～60%，饮食控制在每笼每日90 g，每笼3只大鼠，自然昼夜节律变化光照，并且保持通风。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。

选18月龄衰老大鼠45只随机分为衰老安静组，0%、30%、50%、70%最大负重训练组，每组8只。抗阻训练方式为尾部负重跑台运动，坡度为35°，让衰老大鼠往跑台上爬，跑速为15m/min。大鼠抗阻训练日训练方案见表1，适应性运动1周后开始正式训练，隔天进行1次，为期8周。

表1 大鼠抗阻训练每日训练方案Table1 The training program of rat resistance training per day

1.2 样品采集

负重抗阻训练8周、所有大鼠禁食12 h左右后，称体重，用10%水合氯醛300 mg/kg.wt腹腔注射麻醉后，腹主动脉取血，即刻取出腓肠肌用冷生理盐水漂洗去血液，滤纸吸干，用锡箔纸包裹，立即置于液氮中速冻，转放于-70℃冰箱保存。

1.3 测试指标与检测步骤

Bcl-2、Bax mRNA采用RT-PCR方法检测，仪器为PCR仪，试剂购自美国GeneCopoeia公司。Bcl-2、Bax mRNA检测步骤：（1）RNA抽提；（2）RNA鉴定；（3） 反转录反应；（4）qPCR检测；（5）相对表达量的计算。

线粒体膜电位采用JC-1脂质荧光染料法检测（线粒体膜电位检测试剂盒批号：KGA603，规格：50T），仪器为流式细胞仪（美国BD公司，BDFACSCalibur），试剂购自南京凯基生物科技发展有限公司。线粒体膜电位检测步骤：（1）组织匀浆经差速离心法分离出线粒体；（2）提取上述线粒体用PBS清洗2次；（3）取100uL 10×Incubation Buffer，加900uL灭菌去离子水稀释成1×Incubation Buffer，混匀并预热至 37℃；（4）吸取 500uL 1×Incubation Buffer，加入1uLJC-1，涡旋混匀配成JC-1工作液；（5）取500uLJC-1工作液将线粒体均匀悬浮，37℃，5%CO2的培养箱中孵育20min；（6）室温离心（2000rpm，5min）搜集线粒体，用1×Incubation Buffer洗2次；（7）吸取 500uL 1×Incubation Buffer重新悬浮线粒体；（8）上流式细胞仪检测。所有测试指标均由专人测试。

1.4 统计学分析

实验数据以平均值±标准差表示，采用SPSS15.0统计软件包进行统计。显著性差异采用one-way ANOVA检验，显著性水平为P<0.05，极显著性水平为P<0.01。

2 研究结果

2.1 8周抗阻训练对衰老大鼠腓肠肌凋亡调控基因Bcl-2/BaxmRNA比值的影响

衰老安静组与各抗阻训练组大鼠腓肠肌Bcl-2、Bax mRNA表达及比值的比较见表2。8周抗阻训练干预后，与衰老安静组相比，30%、50%最大负重训练组大鼠腓肠肌Bcl-2/Bax mRNA比值的增加有统计学意义（P<0.01，P<0.05）；与0%最大负重训练组比较，30%最大负重训练组Bcl-2/Bax mRNA比值的增加有统计学意义（P<0.05），而50%和70%最大负重训练组的变化无统计学意义（P>0.05）（见表2）。结果表明，抗阻训练使凋亡调控基因Bcl-2/Bax mRNA比值上调，但以中、低强度抗阻训练效果最为显著。

表2 衰老安静组与各抗阻训练组大鼠腓肠肌Bcl-2、Bax mRNA表达及比值的比较Table2 The comparison of gastrocnemius Bcl-2，Bax mRNA expression among ratio of quiet aging group and each resistance training group

2.2 8周抗阻训练对衰老大鼠腓肠肌线粒体膜电位（ΔΨmt）的影响

经过8周抗阻训练干预后，与衰老安静组相比，各抗阻训练组大鼠腓肠肌线粒体膜电位（ΔΨmt）下降的细胞百分率均减少。其中，0%、30%、50%最大负重训练组的减少具有统计学意义（P<0.01）；与0%最大负重训练组比较，30%最大负重训练组的减少有统计学意义（P<0.05），而50%和70%最大负重训练组的变化无统计学意义（P>0.05）（见表3）。结果表明，抗阻训练可以不同程度地减少衰老大鼠腓肠肌线粒体ΔΨmt下降的细胞百分率，但以中、低强度抗阻训练效果显著。

表3 衰老安静组与各抗阻训练组大鼠线粒体ΔΨmt下降的细胞百分率比较Table 3 The comparison of the percentage in cell reducing among aging control group’s mitochondrial membrane potential（ΔΨmt）and each resistance training group

线粒体膜电位见图1。各图中，右上象限为线粒体ΔΨmt正常的细胞百分率，即JC-1聚积于线粒体膜，而右下象限为线粒体ΔΨmt发生下降的细胞百分率，即JC-1释放为单体。线粒体ΔΨmt下降的细胞百分率减少，即发生凋亡的细胞呈减少趋势。

3 分析与讨论

Bcl-2家族蛋白诱导细胞凋亡的机制主要有2种：（1）Bcl-2家族蛋白精确地改变线粒体膜的通透性；（2）Bcl-2家族蛋白能够诱导MPTP开放。目前发现，Bcl-2家族有15个成员，按功能可分为抗凋亡（Bcl-2、Bcl-xL等）和促凋亡（Bax、Bad、Bid等）2大家族[4]。这2大家族蛋白相互结合、彼此抑制，其比例决定着线粒体对调亡信号的感受性[5]。

目前己经发现，运动过程中与细胞凋亡密切相关的蛋白是Bcl-2和Bax，Bcl-2/Bax比值很大程度上决定了细胞的存活或凋亡[6]。当Bax表达增强时，促进细胞凋亡；Bcl-2的表达增强时，细胞的存活期则延长，抑制细胞凋亡。因此，只有当Bcl-2/Bax比值在适宜的范围内时，细胞才能存活，Bcl-2 mRNA、Bax mRNA通过编码Bcl-2/Bax蛋白发挥作用。

BAKER等[7]对35月龄F344×BN大鼠跖肌进行研究，结果表明，跖肌中Bax与Bcl-2有所下降，且Bax/Bcl-2比值也下降了67%，这意味着促凋亡信号在增龄过程中减弱。SONG等[8]研究发现，老年安静组大鼠腓肠肌Bax表达水平显著上调，Bcl-2表达水平下调，且腓肠肌中Bax/Bcl-2比值随增龄上调。金其贯[3]研究了不同负荷游泳训练对大鼠细胞凋亡的影响，结果也表明，大鼠骨骼肌细胞中Bcl-2蛋白表达经适量的运动训练后增加，经长期的力竭训练后表达下降，继而诱发细胞凋亡。SIU等[9]发现，SD大鼠经8周（5次/周）跑台训练后，比目鱼肌中Bcl-2 mRNA表达及其蛋白表达上调，而Bax mRNA表达及其蛋白表达却有所下调，Bcl-2/Bax mRNA比值增大，表明运动后比目鱼肌中DNA降解程度有所减弱。SONG等[8]研究发现，12周的跑台运动能增加衰老骨骼肌中的Bcl-2含量，但腓肠肌和比目鱼肌中DNA的降解、Caspase-3、Bax以及Bax/Bcl-2比值却均显著下降。另有研究发现，剧烈运动后，Bcl-2/Bax的比值降低启动细胞凋亡，但经过一段时间休息后，Bcl-2/Bax值反而升高[10]。上述研究表明，衰老过程中Bcl-2/Bax比值均降低，从而启动细胞凋亡，但长期有氧运动或长期有规律的训练可使Bcl-2/Bax比值增加，减弱细胞凋亡，从而减少肌肉丢失。

本研究结果表明，衰老大鼠经8周抗阻训练干预后，与衰老安静组相比，各抗阻训练组大鼠腓肠肌Bcl-2、Bax mRNA表达水平及其Bcl-2/Bax mRNA比值出现不同程度的变化。其中，Bcl-2 mRNA表达水平在30%和50%最大负重训练下的增加有统计学意义（P<0.01，P<0.05）；Bax mRNA表达水平在30%和50%最大负重训练下的减少有统计学意义（P<0.01，P<0.05）；Bcl-2/Bax mRNA比值在30%和50%最大负重训练下的增加有统计学意义（P<0.01，P<0.05）。说明，适宜负荷的抗阻训练能上调腓肠肌Bcl-2/Bax mRNA比值，减少细胞凋亡。由于抗凋亡蛋白Bcl-2和Bax竞争性地与ANT结合，抑制Bax所介导的线粒体膜蛋白通道的形成，精确地调控线粒体膜的通透性，阻止MPTP的开启，进而调控线粒体ΔΨmt的变化。因此，Bcl-2/Bax mRNA比值的变化与线粒体膜电位有一定的联系，本实验对线粒体ΔΨmt的测试结果也有力地证实了这一结论。在本实验中，各抗阻训练组大鼠线粒体ΔΨmt下降的细胞百分率出现减少，与衰老安静组相比，0%、30%、50%最大负重训练组的减少有统计学意义（P<0.01）；与0%最大负重训练组比较，30%最大负重训练组的减少有统计学意义（P<0.05），而50%和70%最大负重训练组的变化无统计学意义（P>0.05）。说明，经过8周抗阻训练能抑制衰老大鼠线粒体膜通透性升高和MPTP开放，从而抑制ΔΨmt下降，线粒体功能得到一定的改善，且其效果与负荷强度有关。这表明，8周抗组训练能改善衰老大鼠腓肠肌Bcl-2/Bax mRNA表达水平，使Bcl-2/Bax mRNA比值升高，相应地改善线粒体功能，提高线粒体ΔΨmt。但与之对应的抗阻力训练组，大鼠腓肠肌Bcl-2/Bax mRNA比值的下降有统计学意义（P<0.01，P<0.05），而线粒体ΔΨmt下降的细胞百分率的减少有统计学意义（P<0.01），这也证实了影响线粒体功能的因素较多，比如Ca2+、活性氧、氧化应激等。

4 结 论

8周不同负重抗阻训练能不同程度改善衰老大鼠腓肠肌凋亡调控基因的表达水平，上调Bcl-2/Bax比值，相应地降低线粒体膜电位下降的细胞百分率，改善线粒体功能，且低、中等负重抗阻训练效果较好。

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