滋补肝肾复方对MCAO大鼠脑组织MLCP的调控作用*

2013-10-28胡怀强周永红王树才曹秉振

天津中医药 2013年1期

胡怀强，周永红，王树才，曹秉振

（1.中国人民解放军济南军区总医院神经内科，济南 250031；2.青岛大学医学院，青岛 266071）

脑梗死后神经功能重塑的因素十分复杂，包括促进因素和抑制因素，能否有效解除抑制效应是中枢神经再生的关键[1]。Rho/ROCK信号通路在传导髓磷脂相关抑制因子引起肌动蛋白细胞骨架重组、生长锥塌陷及抑制神经突起延伸过程中起着关键作用，已成为神经损伤发生的重要病理机制[2]。研究表明[3]，滋补肝肾复方可以诱导中枢神经系统产生有利的微环境促进神经再生，并显著抑制Nogo-A表达，促进脑梗死后的神经发生。本研究首次通过给予滋补肝肾复方，观察局灶性脑缺血模型大鼠梗死周围脑组织中Rho/ROCK信号通路的关键因子肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP）的变化，探讨滋补肝肾复方在脑梗死后神经再生、功能重塑中的作用机制。

1 材料和方法

1.1 动物和分组成年无特定病原体（SPF）级雄性SD大鼠60只，体质量250~300 g，由山东大学实验动物中心提供，实验动物生产许可号：SCXK（鲁）20090001（山东省科学技术厅），实验动物质量合格证号：鲁动质号0005215（山东省实验动物管理委员会），检疫后备用，自由摄食进水。颗粒大鼠饲料，由济南康大饲料与山东省实验动物中心联合生产，许可证号：鲁饲准字364号。实验过程中动物饲养及取材均遵守实验动物管理和保护的有关规定。实验动物购买后，在实验室内预适应饲养1周，1周后按随机数字表法随机分为：正常对照组、假手术组、模型组和药物组共4个大组，正常对照组、假手术组各10只，模型组和药物组各20只。

1.2 药物与试剂滋补肝肾复方，主要药物为何首乌、草决明、桑寄生、海马、淫羊藿等，由山东鲁信药业有限公司生产，批号：2011040101，并按照成人剂量的20倍[9 g/（kg·d）]将其制成水溶液，浓度为0.9 g/mL（即10 mL/kg），置于4℃冰箱中备用。兔抗大鼠MLCP多克隆抗体，由Sigma-Aldrich公司提供。

1.3 大脑中动脉阻塞（MCAO）模型的制备在Longa EZ等[4]报道的方法基础上改良后行MCAO术制作局灶性脑缺血模型。MCAO模型成功的判断标准采用Longa EZ评分标准[4]：0分，无神经缺损表现；1分，对侧前爪不能充分伸展；2分，向外侧转圈；3分，行走时向对侧倾倒；4分，不能行走，意识丧失。动物清醒后进行神经功能评分，1~3分者为纳入标准，0分和4分者剔除。

1.4 给药方法于造模成功24 h后给药，药物组灌胃给予滋补肝肾复方水溶液10 mL/kg，余各对照组分别灌胃给予10 mL/kg的蒸馏水，每日1次，并于取材当天停药。固体饲料和水自由摄取。

1.5 标本制备在取材的各时间点，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉后，4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PBS）灌注固定取脑，然后将其浸于4%多聚甲醛中后固定。常规脱水浸蜡包埋，于正中隆起水平在切片机上行4 μm连续冠状切片。

1.6 脑梗死体积测定及比较每组大鼠于造模1周神经功能缺损评分后迅速断头取脑，放入预冷的生理盐水中，并在-20℃冰箱放置10 min，使脑微硬，去掉嗅球、小脑和低位脑干，剩下的部分沿视交叉从前至后立即冠状切成5片，经2%氯化三苯基四氮哇（TTC）37℃染色30 min后，用10%的甲醛缓冲液固定过夜。HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统测量各层梗死灶面积并储存，计算体积。计算公式V＝∑[（S1+S2）÷2×h]（V：总容积；S1，S2：每一切片上下两面病灶面积；h：层面厚度）[5]，以梗死灶体积占全脑体积的百分率进行分析。

1.7 免疫组织化学染色切片常规脱蜡至水。30%双氧水（H2O2）1份+蒸馏水10份混合，室温10 min以灭活内源性酶，蒸馏水洗3次。热修复抗原：将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0），电炉加热至沸腾后断电，间隔10 min后，反复1次，自然冷却后用PBS（pH 7.2~7.6）洗涤2次；滴加5%牛血清白蛋白（BSA）封闭液，室温20 min，甩去多余液体，不洗；滴加兔抗大鼠MLCP多克隆抗体（1∶80），4 ℃过夜，PBS（pH 7.2~7.6）洗2 min，3 次；滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃20min。PBS（pH 7.2~7.6）洗2 min，3 次；滴加试剂 SABC，37 ℃ 20 min，PBS（pH 7.2~7.6）洗5 min，4 次；二氨基联苯胺（DAB）显色：使用DAB显色试剂盒，室温显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤；脱水，透明，封片，显微镜观察。免疫组织化学染色阴性对照用生物素化山羊抗兔IgG代替一抗，其余步骤同上，以检查ROCK2免疫反应的特异性。

1.8 图像分析免疫组织化学染色方法检测切片在统一放大倍数下，随机选10个视野，运用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统进行分析，记录平均阳性细胞数。

1.9 统计学方法数据用SAS8.1版统计软件进行分析，计量资料均采用均数±标准差（±s）表示，组间比较单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 滋补肝肾复方对MCAO大鼠神经功能的影响根据Longa EZ评分标准对治疗后各组MCAO大鼠的神经功能进行了评价，评价结果见表1。

表1 滋补肝肾复方对MCAO大鼠神经功能的影响（±s）Tab.1 Effect of compound prescription of nourishing liver and kidney on the the neural function of the MCAO rats（±s）分

注：与正常对照组比较，▲t=5.80，P＜0.01；治疗后与模型组比较，△t=5.42，P＜0.01。

组别 n Longa EI评分正常对照组 5 0.00±0.00假手术组 5 0.00±0.00模型组 7 2.71±0.49药物组 7 1.29±0.49▲△

应用Longa EZ评分标准对治疗1周后的各组大鼠进行神经功能评分，药物组的神经功能评分较较模型组降低，差异有显著性意义，表明滋补肝肾复方可有效改善MCAO大鼠的神经功能缺损症状。

2.2 滋补肝肾复方对MCAO大鼠脑梗死体积的影响通过TTC染色观察了滋补肝肾复方对各组MCAO大鼠的脑梗死体积的影响，结果见表2。

表2 滋补肝肾复方对MCAO大鼠脑梗死体积的影响（s）Tab.2 Effect of compound prescription of nourishing liver and kidney on the brain infarct volume of the MCAO rats（±s）%

注：与正常对照组比较，▲t＝20.81，P＜0.05；与模型组比较：△t＝7.43，P＜0.01。

组别 n 梗死体积正常对照组 5 0.00±0.00假手术组 5 0.00±0.00模型组 7 23.16±2.14药物组 7 15.57±1.65▲△

TTC是一种水溶性盐类物质，它可以与活细胞线粒体脱氢酶反应生成深红色脂溶性物质，死亡细胞由于线粒体内脱氢酶失活而不显色。即正常组织染成均匀的玫瑰红色，而梗死灶呈白色。正常对照组及假手术组脑组织呈均匀紫红色，没有梗死灶。模型组脑切片上左侧大脑半球有大面积苍白梗死区，而药物组平均梗死体积测定值明显低于模型组，差异有统计学意义（P<0.01），说明滋补肝肾复方可明显减小血管闭塞后脑组织的梗死体积。

2.3 滋补肝肾复方对MCAO大鼠MLCP的影响采用免疫组织化学方法观察MCAO大鼠梗死脑组织周围MLCP表达，结果见表3及图1-4。

表3 滋补肝肾复方对MCAO大鼠脑组织MLCP表达的影响（±s）Tab.3 Effect of compound prescription of nourishing liver and kidney on the expression of MLCP in brain tissue in rats with MCAO（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，P＜0.01。

组别 n 吸光度（A）正常对照组 5 5.01±0.85假手术组 5 5.16±2.08模型组 7 17.91±2.82药物组 7 10.20±4.77*△

图1 正常对照组（10×40）Fig.1 Normal control（10×40）

图2 假手术组（10×40）Fig.2 Sham operation group（10×40）

图3 模型组（10×40）Fig.3 Model group（10×40）

图4 药物组（10×40）Fig.4 Treatment group（10×40）

结果显示，脑梗死后1周时正常对照组和假手术组大鼠脑内的MLCP呈低表达状态，两者之间差异无统计学意义。大鼠脑梗死后脑内的MLCP表达增高，与正常对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01），说明脑梗死后神经再生抑制相关因子开始表达。药物组与模型组比较显示，药物组大鼠脑组织中MLCP表达虽然较正常对照组增多，但较模型组明显减少，两者之间有差异有统计学意义（P＜0.05），说明滋补肝肾复方可抑制MLCP在脑梗死后的表达。

3 讨论

近年来研究表明抑制因素在神经再生过程中扮演着更为重要的角色，迄今中枢神经系统髓磷脂相关的3种主要轴突再生抑制因子已被鉴定，包括Nogo、MAG、OMgp[5]。大量文献资料表明这3种髓磷脂相关抑制因子完全依赖与NgR/P75NTR/Lingo-1膜受体复合物结合激活Rho/ROCK信号通路[6-7]。Rho/ROCK信号通路被称为肌动蛋白细胞骨架的调节器，也是细胞形态异质性的调节器[8]。激活后的Rho/ROCK可以影响许多生物学行为，包括细胞骨架的组装、转录因子的激活、细胞周期的调节等，在中枢神经系统中参与调节突触可塑性。研究发现，在神经发育过程中，Rho/ROCK信号通路参与生长锥的塌陷、抑制轴突发展和短期包绕细胞体等[9]。Rho/ROCK通路参与从轴突生长抑制因子到生长锥的肌动蛋白细胞骨架信号换能过程[10]。因此，Rho/ROCK信号通路在传导髓磷脂相关抑制因子引起肌动蛋白细胞骨架重组、生长锥塌陷及抑制神经突起延伸过程中起着关键作用，已成为神经损伤发生的重要病理机制[11]。由此可见，阻断Rho/ROCK信号通路可促进轴突再生及神经功能恢复[12]。

MLCP是一种肌球蛋白限制的特异性去磷酸化Thr-18、Ser-19的磷酸酶，由38 kU催化亚单位（protein phosphatase 1c）、110~130 kU 调节亚单位（MBS或MYPT 1）和20 kU肌动蛋白结合亚单位组成。其调节亚单位MYPT 1接受Rho/ROCK的活化信号发生磷酸化修饰，导致MLCP失活[13]，从而失去对已磷酸化肌球蛋白的脱磷酸作用，使得胞浆内磷酸化肌球蛋白轻链（MLC）水平增高，肌动—肌球蛋白交联增加，从而影响肌动蛋白聚集和解聚过程，促进肌动蛋白微丝骨架的收缩与聚合，最终导致生长锥塌陷、回缩，轴突生长停止[14-15]。Rho激酶抑制剂可显著降低移植细胞凋亡、增加细胞繁殖能力、促进神经发生[16]。

中医认为，脑梗死的主要病机是机体在各种病理因素作用下，机体阴阳失调，肝肾阴精受损，风火痰气血等病理产物旋而变生，在各种诱因作用下引发而致。其病机关键为肝肾阴虚，肝肾阴虚成于中风之先，是脑梗死发病的根本。中医脑髓与中枢神经在解剖上具有同源性，肝肾与脑髓密切相关性，滋补肝肾使肾精充足，脑髓得养，神机得复，对维持脑内神经元的相对恒定，抗损伤修复机制中占主导地位，因此滋补肝肾是促进中枢神经再生的重要方法[17]。滋补肝肾复方是山东省名中医药专家王新陆教授所创，是临床治疗脑梗死的有效方剂，由何首乌、桑寄生、草决明、海马、淫羊藿组成，此方针对脑梗死“肝肾阴虚为本”的病机特点而设，旨在滋补肝肾。方中诸药合用，一则靶向明确，二则燮理阴阳，三则肝肾并补，四则峻缓适宜，并具有补中寓行，寓调于补，调补结合，滋而不腻的特点。研究结果表明，药物组大鼠脑组织中MLCP表达虽然较正常对照组增多，但较模型组明显减少，说明滋补肝肾复方可抑制MLCP在脑梗死后的表达。表明滋补肝肾复方可通过抑制神经生长负性调控因子的表达，而对脑梗死后的神经发生过程有促进作用。

[1]Zeng JS,Li H,Hong H.The synaptic reconstruction and expression of inhibitory protein in the thalamus and striatum after experimental cerebral infaction in rats[J].Chin J Clin Rehabi,2002,6(17):2534-2535.

[2]Mueller BK,Mack H,Teusch N.Rho kinase,a promising drug target for neurological disorders[J].Nat Rev Drug Discov,2005,4(5):387-398.

[3]胡怀强，周永红，马学盛，等.复健片对大鼠脑梗死后不同时间点Nogo-A 表达的影响[J].中国实验动物学报，2010，18（2）:118-121.

[4]Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebra artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke， 1989，20:84-91.

[5]Mehta NR,Lopez PH,Vyas AA,et al.Gangliosides and Nogo receptors independently mediate myelin-associated glycoprotein inhibition of neurite outgrowth in different nervecells[J].JBiol Chem,2007,282(38):27875-27886.

[6]Ding J,Li QY,Yu JZ,et al.Fasudil,a Rho kinase inhibitor,drives mobilization of adult neural stem cells after hypoxia/reoxygenation injury in mice[J].Mol Cell Neurosci,2010,43(2):201-208.

[7]Alabed YZ,Grados-Munro E,Ferraro GB,et al.Neuronal responses to myelin are mediated by rho kinase[J].J Neurochem,2006,96(6):1616-1625.

[8]Numano F,Inoue A,Enomoto M,et al.Critical involvement of Rho GTPase activity in the efficient transplantation of neural stem cells into the injured spinal cord[J].Mol Brain,2009,2(1):37.

[9]Gopalakrishnan SM,Teusch N,Imhof C,et al.Role of Rho kinase pathway in chondroitin sulfate proteoglycan-mediated inhibition of neurite outgrowth in PC12 cells[J].J Neurosci Res,2008,86(10):2214-2226.

[10]Yang P,Wen HZ,Zhang JH.Expression of a dominantnegative Rhokinase promotes neurite outgrowth in a microenvironment mimicking injured central nervous system[J].Acta Pharmacol Sin,2010,31(5):531-539.

[11]Mueller BK,Mack H,Teusch N.Rho kinase,a promising drug target for neurological disorders[J].Nat Rev Drug Discov,2005,4(5):387-398.

[12]Kubo T,Yamashita T.Rho-ROCK inhibitors for the treatment of CNS injury[J].Recent Pat CNS Drug Discov,2007,2(3):173-179.

[13]Patel CA,Rattan S.Spontaneously tonic smooth muscle has characteristically higher levels of RhoA/ROK compared with the phasic smooth muscle[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2006,291:830-837.

[14]Rajnicek AM,Foubister LE,McCaig CD.Temporally and spatially coordinated roles for Rho,Rac,Cdc42 and their effectors in growth cone guidance by a physiological electric field[J].JCellSci,2006,119:1723-1735.

[15]Loirand G,Guérin P,Pacaud P.Rho kinases in cardiovascular physiology and pathophysiology[J].Circ Res,2006,98(3):322-334.

[16]Koyanagi M,Takahashi J,Arakawa Y,et al.Inhibition of the Rho/ROCK pathway reduces apoptosis during transplantation of embryonic stem cell-derived neural precursors[J].J Neurosci Res,2008,86(2):270-280.

[17]胡怀强，周永红，王新陆.试论滋补肝肾是促进中枢神经再生的重要方法[J].天津中医药，2009，26（4）：296-298.